耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌MSP05的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

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(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222005) (2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222005)

蛋白酶是目前工業(yè)化應(yīng)用最成功的酶類,占據(jù)了酶制劑市場的65%以上[1]。蛋白酶在水相催化中可以將蛋白分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸[2]。在有高濃度有機(jī)溶劑的體系中,酶催化反應(yīng)會(huì)快速向氨基酸脫水縮合形成肽鍵方向進(jìn)行,選擇性地催化肽鍵與酯鍵的形成,可以被應(yīng)用于一些重要中間體的合成及手性藥物的拆分[3]。但大多數(shù)蛋白酶在高濃度的有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性差,而通過生物催化工程對酶進(jìn)行化學(xué)修飾、酶固定化等改造又有成本高、操作復(fù)雜,且常常以降低酶活為代價(jià)的缺點(diǎn)[4-5],這極大地限制了蛋白酶有機(jī)相催化的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

耐有機(jī)溶劑蛋白酶是一類新穎的極端酶,它們在有機(jī)溶劑中具有穩(wěn)定的天然特性,是非水酶學(xué)發(fā)展的新資源。耐有機(jī)溶劑蛋白酶通常由耐有機(jī)溶劑極端微生物產(chǎn)生,篩選耐有機(jī)溶劑極端微生物成為獲得天然耐受有機(jī)溶劑蛋白酶的主要手段。目前已經(jīng)有假單胞菌[6]、蠟狀芽孢桿菌[7]及沙雷氏菌[8]等產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的報(bào)道。已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶一般對疏水性具有耐受性,對親水性有機(jī)溶劑耐受性較弱,且對pH變化較為敏感,在非最佳pH的反應(yīng)體系中活力顯著降低。因此,篩選到具有良好性質(zhì)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶,可以豐富耐有機(jī)溶劑蛋白酶的種類,促進(jìn)該類酶的應(yīng)用,并為進(jìn)一步研究耐有機(jī)溶劑酶的耐受機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究通過富集培養(yǎng),從連云港燕尾港海域海水樣品篩選得到有機(jī)溶劑耐受菌株25株,并從中篩選獲得了一株高產(chǎn)有機(jī)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶產(chǎn)生菌MSP05,對菌株MSP05進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定,并對該菌株及其產(chǎn)生的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的耐有機(jī)溶劑特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥樣品 取自連云港燕尾港受污染海域(34°29′0″N,119°47′0″E);酪蛋白 上海阿拉丁試劑;酵母粉(Yeast extract)、蛋白胨(Tryptone) 分析純,英國Oxoid公司;微生物裂解液(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)、Premix Taq Version 2.0 Takara公司;脫脂奶粉 完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司;豆粕粉、D-果糖、MgSO4等試劑 均為分析純,上海博微微生物科技有限公司;初篩培養(yǎng)基(g/L)脫脂奶粉10.0,酵母粉5.0,MgSO40.4,添加10%甲苯(V/V),海水配制,pH自然;復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)脫脂奶粉10.0,酵母粉5.0,瓊脂20.0,50%海水配制,pH自然;發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)豆粕粉10.0,D-果糖6.0,MgSO40.6,蒸餾水配制,pH自然。

680 ELX-800酶標(biāo)儀 美國BIO-TEK公司;170-6701 PCR儀、GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;DYCP-31DN電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選

1.2.1.1 耐有機(jī)溶劑菌株的篩選 將海泥樣品加入50 mL含有20%(V/V)甲苯的初篩培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)接到同種培養(yǎng)基中,重復(fù)三次。培養(yǎng)液稀釋105后,吸取20 μL涂布于LB培養(yǎng)基。28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取菌落形態(tài)不同的菌株,劃線純化至純種后保藏備用。

1.2.2.2 耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選 將1.2.1獲得微生物(MSR02、MSR03、MSP05、MSP06、MSP07)點(diǎn)種于復(fù)篩培養(yǎng)基平板,28 ℃培養(yǎng)48 h,測定菌落直徑與透明圈直徑,選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后,4 ℃、13400×g離心15 min,上清液用于測定蛋白酶活力。取上清液1 mL加入1 mL的甲苯,在30 ℃、180 r/min振蕩處理4 h后,檢測蛋白酶活力,選擇剩余酶活力高的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 菌種的鑒定 對菌株MSP05進(jìn)行革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)觀察并進(jìn)行部分生理生化特征鑒定[9-10]。進(jìn)一步對菌株16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增[11],序列測定后提交GeneBank,BlastN搜索同源序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 耐有機(jī)溶劑蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.3.1 粗酶液的制備 將保存的菌種接種到LB培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后,以3%的接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,8 ℃,180 r/min培養(yǎng)36 h,4 ℃條件下13400×g離心15 min,上清液即為粗酶液。

1.2.3.2 蛋白酶活力測定 采用Folin法測定蛋白酶活力[11],使用1%酪蛋白溶液作為底物。

每1單位(U)蛋白酶活力定義為在測定條件下,每毫升粗酶液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量(μg/mL·min)。

1.2.3.3 溫度對酶活力及穩(wěn)定性的影響 取1 mL粗酶液和1 mL底物在pH9.0分別于0、20、30、40、50、60、70 ℃下反應(yīng)30 min后，測定蛋白酶酶活力,確定最適反應(yīng)溫度。酶液分別在20、30、40、50、60 ℃下保溫30、60、90、120、150 min后測定蛋白酶酶活,確定蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.3.4 pH對酶活力的影響 分別取1 mL粗酶液與1 mL pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的底物，在50 ℃下反應(yīng)10 min后測定蛋白酶酶活力。

1.2.3.5 金屬離子對酶活力的影響 在1.2.3.2中的測定體系中分別添加CaCl2、CuSO4、FeSO4、MgSO4、ZnSO4、KCl、NaCl金屬離子溶液,使金屬離子終濃度分別為5.0 mmol/L和10.0 mmol/L,測定蛋白酶酶活力,確定金屬離子對酶活力的影響。

1.2.3.6 有機(jī)溶劑對蛋白酶酶活力的影響 將20 mL復(fù)篩培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上均勻打孔,孔直徑10 mm。對Gock報(bào)道的方法[4]稍作修改,粗酶液中加入相同體積的環(huán)己烷、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、正己醇、甲醇、正庚烷、二甲苯,使有機(jī)溶劑濃度達(dá)到50%(V/V),25 ℃、140 r/min,分別振蕩24 h和72 h。每個(gè)孔中分別加入處理后的酶液150 μL,30 ℃靜置3 h,觀察透明圈形成狀況,對剩余酶活力進(jìn)行初步判斷。以不加有機(jī)溶劑處理的酶液為對照,分別對處理后酶的剩余酶活力進(jìn)行測定,確定蛋白酶MSP05對不同有機(jī)溶劑的耐受性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,并用Origin 8.0軟件進(jìn)行曲線圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶菌株的篩選

從燕尾港海域的樣品中分離得到耐有機(jī)溶劑極端微生物25株,復(fù)篩獲得蛋白酶產(chǎn)生菌7株,選取透明圈直徑與菌落直徑比值最大的5株菌發(fā)酵制粗酶液,用甲苯處理粗酶液,測定剩余酶活力,結(jié)果見表1。菌株MSP06的透明圈直徑與菌落直徑比值大于MSP05,表明菌株MSP06所產(chǎn)蛋白酶活力高于MSP05,但處理后的MSP05保持高達(dá)97.8%的剩余酶活力,表明菌株MSP05所產(chǎn)蛋白酶具有更好的有機(jī)溶劑耐受特性,因此選擇菌株MSP05進(jìn)行下一步研究。

表1 耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩Table 1 A primary screen for organic solvent tolerant protease producing bacteria

2.2 菌種鑒定

如圖1所示,菌株MSP05為革蘭氏陽性菌。該菌在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,菌落白色,半透明,光滑濕潤狀、中心稍突起(圖2)。菌株MSP05的部分生理生化特性研究結(jié)果見表2,該菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣、產(chǎn)吲哚、檸檬酸鹽利用和苯丙氨酸脫氫酶陰性、V.P.反應(yīng)陽性、甲基紅反應(yīng)陰性、硫化氫產(chǎn)生陽性,過氧化氫酶、淀粉酶陽性、明膠酶弱陽性,卵磷脂酶、酪蛋白酶、脲酶陽性,O/F反應(yīng)葡萄糖為氧化型,D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、蔗糖和蕈糖為F型。通過菌落形態(tài)和生理生化性質(zhì),將菌株MSP05初步鑒定為芽孢桿菌屬。

圖1 菌株MSP05形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of the strain MSP05(400×)

圖2 菌株MSP05菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphologyof strain MSP05

表2 菌株MSP05的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Characterzations of physiological and biochemistry experiments of strain MSP05

PCR擴(kuò)增獲得的MSP05的16S rDNA長度為1,431 bp,將序列提交GenBank,獲得登陸號:KY378894。將序列進(jìn)行BLAST序列同源性分析，結(jié)果表明MSP05與BacillusamyloliquefaciensY14(CP017953.1)相似度最高,達(dá)99%。選取相似度最高的部分序列,利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3,菌株MSP05與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensY14聚于一支。結(jié)合菌株形態(tài)特征及生理生化特性,最終將菌株MSP05鑒定為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖3 基于菌株MSP05 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Rooted phylogenetic tree of isolate MSP05 to other Bacillus species

2.3 耐有機(jī)溶劑蛋白酶MSP05的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對酶活力及穩(wěn)定性的影響 如圖4所示，該蛋白酶在50 ℃時(shí)活力最高，在20～60 ℃的范圍內(nèi)保持50%以上的酶活力，當(dāng)孵育溫度為70 ℃、孵育時(shí)間30 min時(shí)，剩余酶活力為43.2%。蛋白酶MSP05的熱穩(wěn)定性如圖5所示,低溫(≤40 ℃)對蛋白酶MSP05的穩(wěn)定性影響較小,在40 ℃孵育150 min之后,蛋白酶的仍保持60%以上的剩余酶活。當(dāng)孵育溫度達(dá)到60 ℃、孵育時(shí)間30 min時(shí),剩余酶活力僅為7%。高溫環(huán)境能夠很快改變蛋白酶的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響蛋白酶的活力。

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of the protease

圖5 溫度對蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of the protease

2.3.2 pH對酶活力的影響 蛋白酶MSP05對弱酸或弱堿反應(yīng)環(huán)境不敏感,對強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境較為敏感。如圖6所示,在pH6.0～13.0的范圍內(nèi),蛋白酶都能保持70%以上的酶活力,在pH10.0的條件下,蛋白酶的酶活力達(dá)到最高,當(dāng)pH小于6.0或大于13.0時(shí),蛋白酶的酶活力迅速降低至40%以下。過酸或過堿的環(huán)境會(huì)使酶蛋白變性失活,從而降低酶活力。

圖6 pH對酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of the protease

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響 表3顯示了9種不同金屬離子在2種濃度(5和10 mmol/L)下對蛋白酶活力的影響。由表3可知,在5和10 mmol/L,Fe3+、Mg2+和Ba2+對蛋白酶MSP05的活里具有明顯的抑制作用;Mn2+和Cu2+對該酶的酶活具有明顯的激活作用;其余的金屬離子對該酶的活力具有不同程度的抑制作用。Mn2+、Cu2+在兩種濃度下都對酶能起到明顯的激活作用,可能是因?yàn)檫@些金屬離子可以和堿基等形成穩(wěn)定的簇聚離子,從而起到激活酶活的作用。

表3 金屬離子對酶活力的影響Table 3 Effect of metal ions on the activity of the protease

2.3.4 有機(jī)溶劑對蛋白酶活力的影響 圖7(a、b)分別顯示了有機(jī)溶劑處理蛋白酶24 h和72 h后在復(fù)篩培養(yǎng)基上透明圈形成的情況。處理后的蛋白酶透明圈沒有明顯縮小,蛋白酶MSP05能夠耐受有機(jī)溶劑。初步判定蛋白酶MSP05具有有機(jī)溶劑耐受性。

圖7 有機(jī)溶劑處理后蛋白酶透明圈形成情況Fig.7 Transparent loop of protease after treated with different organic solvents注:A:環(huán)己烷;B:乙醇;C:乙酸乙酯;D:甲苯; E:正己醇;F:甲醇;G:正庚烷;a:24 h,b:72 h。

8種不同的有機(jī)溶劑分別處理24 h和72 h后蛋白酶的剩余酶活力見表4。甲苯、環(huán)己烷、正庚烷、二甲苯中的剩余酶活力較對照組更高。甲苯處理72 h后蛋白酶MSP05剩余酶活力甚至高達(dá)125.92%。乙酸乙酯、甲醇、乙醇會(huì)抑制酶活力,乙醇處理72 h后,剩余酶活力僅為51.23%。

表4 有機(jī)溶劑對酶活力的影響Table 4 Effect of different organic solvents on protease activity

3 討論與結(jié)論

目前已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶主要來自陸源,多是從污水處理廠[12]、石油污染的土壤[7]中篩選得到,也有來從湖泊水樣中篩選到的報(bào)道[13]。來自于海洋的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的報(bào)道很少,僅有從原油污染的海底沉積物篩選的的枯草芽孢桿菌[14]等。解淀粉芽孢桿菌是抗菌防病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的報(bào)道較多,但其產(chǎn)生耐有機(jī)溶劑蛋白酶在國內(nèi)尚未見諸報(bào)端。

本研究從長期受化工污染的海域中分離獲得的一株產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的菌株MSP05為革蘭氏陽性菌,鑒定為解淀粉芽孢桿菌。已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶對有機(jī)溶劑的耐受性一般不強(qiáng),當(dāng)有機(jī)溶劑濃度達(dá)到20%后,蛋白酶的活力會(huì)有顯著降低[15-16]。因?yàn)橛H水性的有機(jī)介質(zhì)會(huì)與酶爭奪微量水,破壞酶的天然構(gòu)象,影響酶活力,已報(bào)道蛋白酶對親水性有機(jī)溶劑的耐受性也較弱,在經(jīng)過親水性有機(jī)溶劑處理后,酶活力通常會(huì)出現(xiàn)顯著降低,在10%濃度的甲醇處理后,通常殘留50%的酶活力[15]。而蛋白酶MSP05在經(jīng)過50%(V/V)乙醇處理72 h后仍能保持51.23%酶活力。已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶通常對溫度和pH條件敏感,一般僅在中溫、堿性的條件下(60 ℃,pH8.0)具有較高酶活力[16-18]。菌株MSP05產(chǎn)蛋白酶對pH和溫度具有較好的適應(yīng)性。

本研究分離獲得的耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌MSP05及其蛋白酶具有較好的耐有機(jī)溶劑特性。該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50 ℃和10.0,Cu2+、Mn2+對酶有激活作用,Mg2+、Fe3+和Ba2+對酶具有抑制作用。在50%甲苯處理72 h后蛋白酶MSP05剩余酶活力達(dá)125.92%。這種新穎的耐有機(jī)溶劑蛋白酶為有機(jī)相中蛋白酶催化合成反應(yīng)提供了酶類資源,具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。