超聲預(yù)處理時(shí)間對金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放的影響

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(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715; 2.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北邯鄲 056005; 3.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013)

許多食源性多肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性,可競爭性結(jié)合ACE活性部位的Zn2+,有降壓作用[1],且ACE抑制肽食用安全性高,無毒副作用,對正常血壓沒有影響[2],具有較廣闊的市場前景。目前已經(jīng)從乳蛋白、玉米蛋白、明膠等食物蛋白中提取出很多種ACE抑制肽[3-6]。金槍魚是一種重要的世界經(jīng)濟(jì)魚類,營養(yǎng)豐富,通常只選取其魚肉進(jìn)行加工,而魚皮作為副產(chǎn)品沒有被充分利用,造成很大的資源浪費(fèi)。金槍魚皮富含膠原蛋白,可用作ACE抑制肽的良好來源。因?yàn)槟z原蛋白的三螺旋區(qū)域富含羥脯氨酸(Hyp)或脯氨酸(Pro),因此來自于膠原三螺旋區(qū)的肽段C末端多含有Pro,當(dāng)脯氨酸在C末端的任一位置時(shí),均有很強(qiáng)的降壓活性[7];此外,Hyp可催化ACE抑制肽與ACE結(jié)合。但膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,除了金屬蛋白酶,普通蛋白酶很難進(jìn)入其結(jié)構(gòu)內(nèi)部,很難接觸活性位點(diǎn),釋放高ACE抑制活性肽段較難,因而需在酶解前進(jìn)行預(yù)處理,使其三螺旋結(jié)構(gòu)松散,酶切位點(diǎn)暴露。傳統(tǒng)預(yù)處理如熱處理、堿液處理等方式操作耗時(shí)長,效率低,如以魷魚皮[8]、鱈魚皮[9]等制備膠原ACE抑制肽,酶解前熱處理時(shí)間分別長達(dá)24、30 h,從而需要尋找更高效的預(yù)處理方式,使魚皮ACE抑制肽的釋放效率提高。

本研究利用前期優(yōu)化的條件制備金槍魚皮ACE抑制肽,對金槍魚皮超聲預(yù)處理后再進(jìn)行酶解,研究不同超聲預(yù)處理時(shí)間下金槍魚皮ACE抑制肽的釋放過程,并通過紅外光譜、熱穩(wěn)定性分析超聲處理的魚皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu),旨在明確超聲預(yù)處理對金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚皮 山東中魯遠(yuǎn)洋(煙臺)食品有限公司;蛋白酶K:30 U/mg 美國Sigma公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、鄰苯二甲醛(OPA)、L-谷胱甘肽 美國Sigma公司;ACE底物(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro) Bachem公司。

Multifuge X3R型冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;KQ-100B型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技公司;LC-20A高效液相色譜 島津公司;Spectrum 100紅外光譜 美國PerkinElmer公司;Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀 美國Bio-Rad公司;Pyris4000差示量熱掃描儀 美國PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚皮超聲預(yù)處理 根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法處理金槍魚皮,解凍后稱取2 g,加入0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)后進(jìn)行超聲預(yù)處理,超聲條件:功率30%(總功率650 W),超聲5 s后間歇10 s;超聲預(yù)處理料液比(g∶mL)為1∶15;超聲時(shí)間分別為0、1、5、20、40 min。U0用來表示未處理組,U1、U5、U20、U40分別表示超聲預(yù)處理1、5、20、40 min。

1.2.2 酶解液的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法制備酶解液,將處理后的金槍魚皮,加入蛋白酶K(酶底比1 mg/g),在37 ℃恒溫?fù)u床上酶解,當(dāng)酶解時(shí)間分別達(dá)到5、30、60 min后,立即90 ℃水浴15 min滅酶,冷卻后在6000 r/min離心15 min,再用0.45 μm的濾膜過濾其上清液,即為酶解液,將一部分冷凍干燥備用。

1.2.3 水解度的測定 參考Zhang等[14]的方法測定水解度。5 mmol/L OPA工作液的制備:由10 mL 50 mmol/L NAC溶液,10 mL 50 mmol/L OPA溶液,75 mL 0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH9.4)和5 mL 20%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液配制而成,現(xiàn)配現(xiàn)用。

將40 μL的酶解液和5 mmol/L的 OPA工作液4.8 mL混勻反應(yīng)10 min后,在λ340 nm處測定吸光值,空白組為水代替酶解液。水解度的計(jì)算公式如下:

式(1)

式(2)

式中:N為膠原蛋白理論肽鍵數(shù);n為水解液中斷裂的肽鍵數(shù);A340為340 nm處的吸光值;M為蛋白質(zhì)的分子量(300 kDa,以膠原蛋白分子量概算),Da;d為稀釋系數(shù);ε為340 nm處的消光系數(shù)(6000 mol·cm);c為蛋白質(zhì)濃度,g/L,以魚皮中蛋白含量(21.08%)計(jì)[13]。

1.2.4 ACE抑制率的測定 參照Zhang等的方法,稍加改動(dòng)[14-15]。取50 μL酶解液于黑色滴定板(96孔)中,加入6 mU/mL ACE溶液50μL 后,于熒光酶標(biāo)儀振蕩10 s,并在37 ℃下反應(yīng)10 min,然后在每個(gè)反應(yīng)孔中加入200 μL 0.45 mmol/L ACE底物反應(yīng)液(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro)后進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測定,每隔1 min測量一次,其中激發(fā)波長為360 nm,吸收波長為415 nm。

式(3)

式中:α為熒光吸收值與測定時(shí)間回歸曲線的斜率。用Tris緩沖液(pH8.3)代替酶解液用作陽性對照組,將ACE溶液代替Tris緩沖液用作空白對照組和陰性對照組[14]。

1.2.5 分子量的測定

1.2.5.1 SDS-PAGE電泳 將酶解液與上樣緩沖液按4∶1 (v/v)的比例混合,沸水浴5 min后迅速冷卻。電泳分離膠為10%,濃縮膠為5%,上樣量為15 μL。

1.2.5.2 酶解液的分子量分布 將5 mg酶解液凍干粉溶于2 mL流動(dòng)相中,采用高效液相色譜(HPLC)分析多肽分子量的分布情況。色譜柱:TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm);流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:220 nm;采用30%乙腈(含有0.1%的三氟乙酸)進(jìn)行等度洗脫。根據(jù)文獻(xiàn)[13]選用4種分子量標(biāo)準(zhǔn)多肽樣品細(xì)胞色素C(Mw=12384 Da)、抑肽酶(Mw=6511.44 Da)、桿菌肽(Mw=1422.69 Da)、谷胱甘肽(Mw=612.63 Da)。

1.2.6 超聲預(yù)處理對金槍魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

1.2.6.1 熱穩(wěn)定性分析 稱取5 mg超聲預(yù)處理后的金槍魚皮凍干粉,用鋁坩鍋密封后放入DSC儀,以 5 ℃/min速率從-5 ℃升溫至180 ℃,記錄其吸熱曲線。

1.2.6.2 紅外光譜分析 取2 mg超聲處理后的金槍魚皮凍干粉,與溴化鉀研磨混勻,60 ℃烘干之后壓片,掃描紅外光譜圖,掃描范圍為400～4000 cm-1,掃描次數(shù)64次,分辨率4 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,使用Spectrum進(jìn)行紅外光譜分析,并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對水解度的影響

由圖1可知,各組酶解液的DH隨酶解時(shí)間增加整體呈現(xiàn)升高趨勢。酶解5 min時(shí),超聲預(yù)處理組都和未超聲組差異顯著(p<0.05),說明超聲預(yù)處理改變了膠原蛋白構(gòu)象,在酶解初期使其酶解模式發(fā)生改變。但隨著酶解的進(jìn)行,超聲對其酶解模式影響并沒有持續(xù),酶解30 min時(shí)超聲組的DH均未顯著高于未處理組(p>0.05),說明超聲預(yù)處理僅暴露了部分結(jié)合位點(diǎn),并未完全破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)。酶解60 min后,超聲處理對膠原酶解的影響再次出現(xiàn),超聲20、40 min組的DH均顯著高于未處理組(p<0.05),表明超聲預(yù)處理可能會對整體酶解過程有促進(jìn)作用。

圖1 超聲預(yù)處理對金槍魚皮膠原蛋白酶解液水解度的影響Fig.1 Effects of ultrosound pretreatment on the degree of hydrolysis of tuna skin collagen注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2同。

2.2 超聲預(yù)處理對金槍魚皮ACE抑制肽釋放的影響

總體而言,超聲預(yù)處理組酶解液ACE抑制率均比未處理組高,說明超聲可促進(jìn)酶解過程ACE抑制肽釋放。超聲產(chǎn)生的空化作用可使膠原蛋白結(jié)構(gòu)展開,造成內(nèi)部酶切位點(diǎn)暴露,促進(jìn)其與蛋白酶K的結(jié)合[16]。經(jīng)5 min酶解后,超聲1 min和20 min后酶解液的ACE抑制率顯著升高(p<0.05),與其水解度較高一致,但DH最高的超聲40 min組沒有出現(xiàn)較高的ACE抑制活性,即此酶解液中高活性ACE抑制肽段所占比例較低。隨著水解進(jìn)一步進(jìn)行,超聲處理40 min組的ACE抑制率明顯升高,且接近或高于其他處理組,可能與其蛋白結(jié)構(gòu)被破壞以及酶切位點(diǎn)暴露的程度有關(guān)。在超聲處理組中,超聲預(yù)處理后只要短時(shí)酶解(5 min)即可達(dá)到較高的ACE抑制率,說明超聲預(yù)處理對金槍魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)有一定破壞作用,使其酶切位點(diǎn)暴露,有助于ACE抑制肽快速釋放。

圖2 超聲預(yù)處理對金槍魚皮酶解液ACE抑制率的影響Fig.2 Effects of ultrosound pretreatment on the ACE inhibitory activity of tuna skin collagen hydrolysate

2.3 分子量分布

利用SDS-PAGE電泳圖分析20 kDa以上的大分子蛋白含量,同時(shí)利用HPLC分析10 kDa以下的小分子多肽含量變化。由圖3和圖4可知,不同超聲處理組的組分含量隨酶解時(shí)間增加呈現(xiàn)往復(fù)增減變化趨勢。酶解5 min時(shí),超聲1～20 min后水解液組分明顯增加,并且隨著超聲時(shí)間增加,條帶顏色逐漸加深,結(jié)合ACE抑制活性變化趨勢,表明超聲1～20 min預(yù)處理能有效暴露膠原內(nèi)部位點(diǎn)。超聲40 min樣品未出現(xiàn)任何條帶,可能是因?yàn)殚L時(shí)間超聲造成膠原大量位點(diǎn)暴露,短期酶解使大量多肽溶出,并作為底物被進(jìn)一步降解為小分子短肽,分子量均低于20 kDa,因此在電泳圖上沒有條帶。圖4顯示酶解5 min超聲40 min水解液中小分子含量大于95%證明了這一假設(shè),在此過程許多有高ACE抑制活性的多肽可能發(fā)生進(jìn)一步降解,使ACE抑制活性偏低。

圖3 不同超聲預(yù)處理組酶解液的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of hydrolysate by different pretreatment注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

圖4 不同超聲預(yù)處理組酶解液10 kDa以下多肽的分子量分布Fig.4 Molecular weight(under 10 kDa)distribution of hydrolysate by different pretreatments

酶解30 min時(shí),未處理組、超聲1 min和5 min組電泳條帶均減少,小于10 kDa的組分含量則大幅上升,這是因?yàn)榈鞍酌概c溶液中的位點(diǎn)接觸幾率遠(yuǎn)高于不溶性膠原主體,從而進(jìn)一步降解此時(shí)溶液中的多肽。而超聲40 min組樣品則呈現(xiàn)相反情況,電泳條帶增加,小于10 kDa的組分含量下降,說明溶液中的作用位點(diǎn)被耗盡后,蛋白酶進(jìn)而將不溶性底物酶解,使溶液中大分子多肽比例增加。酶解60 min時(shí),每組酶解液分子量繼續(xù)呈現(xiàn)往復(fù)增減的變化規(guī)律。說明超聲預(yù)處理后在酶解初期可以加速該規(guī)律進(jìn)行,進(jìn)而使ACE抑制活性肽段釋放加速,然而當(dāng)進(jìn)一步酶解時(shí),該規(guī)律可能繼續(xù)呈現(xiàn)至膠原結(jié)構(gòu)徹底崩潰,超聲預(yù)處理對于酶解的影響也會隨著酶解的進(jìn)行逐漸減小。

2.4 超聲預(yù)處理對金槍魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 超聲處理后魚皮膠原熱穩(wěn)定性分析 通過熱穩(wěn)定性分析可以判斷超聲處理對原料的破壞程度,并可結(jié)合水解液ACE抑制率進(jìn)一步分析位點(diǎn)暴露情況。由圖5(表1)可以看出,未處理金槍魚皮經(jīng)DSC掃描圖譜顯示僅有一個(gè)大峰,但經(jīng)超聲處理1、5 min后,靠近主峰處增加了一個(gè)小峰,超聲處理20、40 min后增加了兩個(gè)小峰,即隨著超聲時(shí)間增加,DSC圖譜在比主峰溫度低的地方有規(guī)律地增加小峰。小峰可能是膠原蛋白的多肽片段或蛋白質(zhì)的氧化造成的[17-18],但由于試驗(yàn)中未超聲組和超聲處理組操作時(shí)間相同,應(yīng)該不是氧化所致,該小峰應(yīng)為膠原蛋白多肽片段。這可能是金槍魚皮經(jīng)超聲處理后,破壞了膠原蛋白共價(jià)交聯(lián)鍵,促進(jìn)了膠原片段的溶出,小峰表現(xiàn)為小分子片段。將超聲后魚皮樣品棄去上清液,收集沉淀干燥后經(jīng)DSC驗(yàn)證,DSC圖譜中僅有一個(gè)峰(表2),且趨勢與主峰熱變性溫度趨勢一致說明確實(shí)是超聲導(dǎo)致的膠原片段溶出而產(chǎn)生的小峰。

圖5 不同超聲預(yù)處理組的膠原蛋白DSC圖譜Fig.5 DSC picture of collagen treated with different ultrosound pretreatments

峰溫度(℃)U0U1U5U20U40主峰63.3761.1461.5762.5667.05第一小峰52.8454.6654.4654.75第二小峰43.4443.81

表2 超聲處理后棄去上清液后魚皮膠原的熱變性溫度Table 2 Tm of fish skin collage after ultrasound pretreatment and centrifugation to discard supernatant

DSC可用于反映膠原蛋白的變性程度[19]。從主峰溫度來看,超聲預(yù)處理改變了金槍魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu),超聲預(yù)處理1～20 min均比未處理組低,說明超聲可使膠原構(gòu)象發(fā)生改變,使熱變性溫度降低。但超聲40 min 后,膠原蛋白主峰的熱變性溫度比未處理組高,可能是因?yàn)殚L時(shí)間的超聲處理導(dǎo)致膠原中共價(jià)鍵被破壞[20-21],大量組分溶出,而未溶出的膠原主體穩(wěn)定性得到加強(qiáng),表現(xiàn)為主峰溫度升高。溶出的組分可被短時(shí)酶解,使酶解5 min、超聲40 min組酶解液的大分子組分減少。

酶解初期超聲處理5、20 min 組主峰的熱變性溫度比未處理組低,而其ACE抑制率顯著性升高(p<0.05),表明此時(shí)超聲主要改變膠原蛋白的三螺旋構(gòu)象,使更多三螺旋區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)暴露,快速釋放ACE抑制肽。當(dāng)超聲預(yù)處理時(shí)間達(dá)到40 min后,蛋白酶迅速水解膠原非主體部分,并進(jìn)一步降解可溶性大分子組分,造成酶解5 min后無SDS-PAGE電泳條帶存在,酶解液小分子含量高,但部分ACE抑制活性高的肽段可能在該過程中被降解,造成水解液ACE抑制活性偏低。

2.4.2 紅外光譜分析 超聲預(yù)處理后金槍魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化如圖6所示。酰胺A帶是N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰,當(dāng)N-H基團(tuán)參與氫鍵形成時(shí),其向低波數(shù)移動(dòng);酰胺B帶是-CH2的不對稱伸縮振動(dòng),當(dāng)-CH2基團(tuán)參與氫鍵時(shí)發(fā)生藍(lán)移;酰胺I帶是C=O的伸縮振動(dòng)峰,波數(shù)越低蛋白中氫鍵作用越高[22-23]。由表3可知,短時(shí)間超聲造成與N-H相關(guān)的氫鍵含量增加,長時(shí)間超聲則破壞了蛋白分子間的氫鍵,可能是因?yàn)殚L時(shí)間超聲造成更多的組分溶出,剩余膠原主體結(jié)構(gòu)中組分減少,造成N-H相關(guān)的氫鍵含量相對減少。酰胺B帶向低波數(shù)移動(dòng),表明維持三螺旋構(gòu)象的分子間和分子內(nèi)締結(jié)氫鍵減少,表明超聲對膠原蛋白構(gòu)象有所破壞。超聲預(yù)處理后各組的酰胺I帶向高波數(shù)移動(dòng),說明超聲處理破壞了蛋白結(jié)構(gòu)中C=O參與的氫鍵作用。

圖6 不同超聲預(yù)處理金槍魚皮的膠原蛋白紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of tuna skin collagen treated with different ultrosound pretreatments

表3 不同超聲預(yù)處理時(shí)間的金槍魚皮膠原蛋白紅外光譜特征峰吸收波Table 3 Infrared spectrogram of tuna skin collagen treated with different ultrasound pretreatments

酰胺III帶和1453 cm-1波數(shù)的面積比值可反映蛋白三螺旋完整度[24]。由表3可知,金槍魚皮經(jīng)超聲處理后,三螺旋結(jié)構(gòu)均遭到不同程度的破壞,超聲20 min組的面積比最小為1.157,說明在此條件下三螺旋結(jié)構(gòu)破壞最嚴(yán)重,使更多三螺旋區(qū)酶結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生暴露,有助ACE抑制肽釋放。超聲40 min后,AIII/A1453比值有所增加,可能是由于部分組分溶出后,剩余的膠原主體結(jié)構(gòu)中類三螺旋結(jié)構(gòu)反而相對更加穩(wěn)定,這與DSC結(jié)果一致。

由表4可知,超聲處理后α螺旋、β折疊比例降低,而無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角含量明顯上升,與胡愛軍等[25]研究結(jié)果一致。這是因?yàn)槌暺茐牡鞍捉Y(jié)構(gòu),使氫鍵斷裂,α螺旋展開,形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),使更多位點(diǎn)暴露,加速酶解過程的進(jìn)行,提高三螺旋區(qū)活性多肽的釋放效率。但超聲40 min后,其α螺旋、β折疊比例略有增加,β轉(zhuǎn)角減少,膠原主體的有序性有所增加,與DSC結(jié)果一致,即該膠原主體熱變性溫度增加。

表4 不同超聲預(yù)處理組金槍魚皮膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Table 4 Secondary structured of collagen that treated with different ultrosound pretreatments

3 結(jié)論

超聲預(yù)處理對金槍魚皮膠原結(jié)構(gòu)有一定破壞作用,改變了酶解模式,且超聲可促進(jìn)短時(shí)酶解過程膠原三螺旋區(qū)域ACE抑制肽快速釋放;同時(shí)酶解過程酶解液組分分子量呈現(xiàn)往復(fù)增減變化,超聲預(yù)處理會加速該規(guī)律的進(jìn)行,以促進(jìn)膠原整體酶解過程的進(jìn)行。

DSC結(jié)果表明,1～20 min的超聲預(yù)處理可導(dǎo)致魚皮膠原熱變性溫度降低,說明短時(shí)超聲預(yù)處理會在一定程度上破壞膠原蛋白構(gòu)象,使ACE抑制肽的釋放效率提高;但40 min的超聲預(yù)處理導(dǎo)致魚皮熱變性溫度升高,原因在于長時(shí)間的超聲處理促使大量組分溶出并快速被降解,使未溶出的膠原主體的熱穩(wěn)定性略有增加。

FTIR結(jié)果表明,超聲預(yù)處理破壞了膠原蛋白內(nèi)部與N-H以及C=O相關(guān)的氫鍵平衡,并減少了維持三螺旋構(gòu)象的分子間以及分子內(nèi)締結(jié)的氫鍵,從而改變蛋白構(gòu)象。金槍魚皮經(jīng)超聲預(yù)處理后,其α螺旋、β折疊比例降低,無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角比例明顯增加,表明三螺旋結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞,整體向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,有助于三螺旋區(qū)的活性肽釋放;與其他處理組相比,超聲處理40 min后,AIII/A1453比值增大,α螺旋、β折疊含量略有增加,β-轉(zhuǎn)角含量減少,表明膠原主體有序性有所增加,剩余的膠原主體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,與DSC結(jié)果一致。