馬鞭草中多酚類物質(zhì)的提取及抗氧化活性檢測

◎ 高 涵，任夢瑤，汪莎莎，于海坤，陳 玲，王冰玉，楊延存

（青島工學(xué)院，山東 青島 266300）

植物多酚（Plant polypheno1）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)[1]，在自然界中非常豐富，含多酚較多的常見植物超過600種，在某些針葉樹皮中多酚含量達(dá)20%～40%，僅此，每年在全球形成了數(shù)以億噸的可再生綠色資源。天然抗氧化劑主要來源于植物多酚[2]，而且，研究表明，植物多酚含量及種類與抗氧化性有關(guān)。馬鞭草（Verbena officinalis L）為馬鞭草科植物的干燥地上部分[3]，對(duì)馬鞭草化學(xué)成分的研究在20世紀(jì)初就已經(jīng)開始，由于其在臨床應(yīng)用中有明顯的療效，近年又發(fā)現(xiàn)有新的藥理活性，因此馬鞭草中的化學(xué)成分及藥效物質(zhì)又引起了新的關(guān)注，馬鞭草中已見報(bào)道的化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜苷、三萜和黃酮類等[4-5]。為了提高對(duì)馬鞭草的利用，本試驗(yàn)擬對(duì)馬鞭草中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取和檢測，并進(jìn)一步檢測其抗氧化能力及提取條件，從而為馬鞭草的進(jìn)一步利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鞭草，購買于膠州農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

750T型多功能粉碎機(jī)（鉑歐五金廠），KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、80-2電動(dòng)離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司），722N型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚提取率的測定

精確量取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中再分別加入3.0 mL福林-酚試劑，搖勻靜置30 s后加入6.0 mL 12%Na2CO3溶液，最后用蒸餾水定容至25 mL，室溫下反應(yīng)2 h，以0樣為空白，在760 nm下測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品多酚提取液1 mL，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測定樣品中多酚含量，以沒食子酸計(jì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果得出多酚提取率計(jì)算回歸方程為A=82.676C+0.002 3，R2=0.999 5，其中，A為樣品吸光度值，C為樣品中多酚提取率。

1.3.2 多酚DPPH清除作用的測定[6-7]

取提取的樣品溶液4 mL于試管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在517 nm處測定吸光度。以蒸餾水做空白對(duì)照，以相同濃度維生素C作對(duì)比。

式中，A1為4 mL樣液+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值；A2為4 mL樣液+2 mL 95%的乙醇對(duì)應(yīng)吸光度值；A3為4 mL蒸餾水+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)不同試劑的預(yù)試驗(yàn)，將馬鞭草分別以不同溶劑（30%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、70%乙醇、蒸餾水）浸泡，在一定溫度（30、40、50、60 ℃和70 ℃）下水浴，提取一定時(shí)間（1、3、5、7 h和9 h）后，檢測多酚提取率。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溶劑（C）進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化多酚類物質(zhì)的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響

為全面考察溶劑對(duì)于多酚提取率的影響，對(duì)甲醇溶液、乙醇溶液進(jìn)行了單獨(dú)試驗(yàn)，挑選出最佳的提取濃度，與蒸餾水一起對(duì)原料中多酚進(jìn)行提取比較，分析提取溶劑對(duì)提取率的影響。結(jié)果如圖1所示，在同條件下，用30%的乙醇提取馬鞭草中多酚類物質(zhì)，提取率最好，其次為70%乙醇與70%甲醇。

圖1 提取試劑對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響圖

2.2 提取溫度對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響如圖2?？梢钥闯?，當(dāng)溫度較低時(shí)，馬鞭草中多酚提取率較低，應(yīng)該是溫度限制了多酚的析出；當(dāng)提取溫度在60 ℃時(shí)，馬鞭草中多酚的提取率最高；當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，多酚提取率有所下降，應(yīng)是過高的溫度導(dǎo)致提取物發(fā)生變質(zhì)或被空氣迅速氧化。

圖2 提取溫度對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響圖

2.3 提取時(shí)間對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響

從圖3可以看出，多酚提取率隨提取時(shí)間的增加出現(xiàn)先增后減的變化趨勢，馬鞭草中多酚提取率在5 h時(shí)達(dá)到峰值。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，提取率不高，是溶出時(shí)間不夠造成的；時(shí)間過長，提取率降低應(yīng)是多酚被緩慢氧化導(dǎo)致。

圖3 提取時(shí)間對(duì)于馬鞭草中多酚提取率的影響圖

2.4 馬鞭草中多酚提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)馬鞭草中多酚提取條件正交試驗(yàn)因素水平表如表1所示。結(jié)果如表2所示。

表1 馬鞭草提取條件正交試驗(yàn)因素水平表

馬鞭草中多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過正交試驗(yàn)，根據(jù)極差的大小判斷各因素對(duì)馬鞭草中多酚提取率的影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即馬鞭草中多酚提取率最主要影響因素為提取溫度，其次為提取時(shí)間、最后是提取溶劑。按照平均值大小選取最優(yōu)水平為A2B2C3，即提取條件為提取溫度60 ℃，提取時(shí)間5 h、溶劑采用40%乙醇，在該條件下馬鞭草中提取率為0.402 4 mg/g，確為最優(yōu)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 馬鞭草中的多酚粗提液抗氧化能力檢測

對(duì)馬鞭草中提取的多酚粗提液進(jìn)行抗氧化能力檢測。在最佳提取條件下提取，采用DPPH清除率法進(jìn)行測定，結(jié)果顯示清除率為25.74%。

3 結(jié)論

本研究以馬鞭草為原料，對(duì)其多酚類物質(zhì)的提取條件及抗氧化活性進(jìn)行研究。試驗(yàn)中對(duì)馬鞭草中多酚提取的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定提取率最高時(shí)的提取條件，研究結(jié)果顯示：對(duì)馬鞭草中多酚類物質(zhì)提取率影響最顯著的是提取溫度，其次為提取時(shí)間，最后是提取溶劑。馬鞭草中提取率最高的提取條件為：提取溫度60 ℃，提取時(shí)間5 h、溶劑采用40%乙醇。在最佳提取條件下馬鞭草的多酚粗提液的DPPH清除率為25.74%。