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    細(xì)鱗魚(yú)嗜水氣單胞菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立

    2018-11-26 03:12:20郭玉丹杜迎春何亞鵬
    江西農(nóng)業(yè) 2018年19期
    關(guān)鍵詞:水氣單胞菌特異性

    郭玉丹 杜迎春 何亞鵬 時(shí) 曉 賈 斌

    (1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子 832003;2.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心,北京 102101)

    細(xì)鱗魚(yú)(Brachymystax lenok)屬鮭形目,鮭科,細(xì)鱗魚(yú)屬,是我國(guó)名貴的陸封型冷水魚(yú)。1988年,細(xì)鱗魚(yú)被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物名錄。近年來(lái)野生細(xì)鱗魚(yú)分布范圍逐漸縮小,野生種群急劇衰退,北京已經(jīng)瀕臨滅絕。

    為了恢復(fù)細(xì)鱗魚(yú)這一珍稀的瀕危物種,人們陸續(xù)開(kāi)展了細(xì)鱗魚(yú)的馴養(yǎng)、繁育及增殖放流工作,并取得了初步的成功。但在細(xì)鱗魚(yú)的人工馴養(yǎng)過(guò)程中,各種疾病頻發(fā),尤其是各類(lèi)細(xì)菌性疾病高發(fā),一旦發(fā)病很難根治,經(jīng)常會(huì)造成毀滅性后果,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此,在馴養(yǎng)繁育中,迫切需要一種快捷、簡(jiǎn)便的方法對(duì)病源菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的診斷,對(duì)疫病進(jìn)行早期預(yù)防和治療。

    本研究的目的就是將LAMP技術(shù)應(yīng)用到細(xì)鱗魚(yú)細(xì)菌性疾病的診斷中來(lái),建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法。

    1 試驗(yàn)材料

    1.1 菌株 嗜水氣單胞菌,由北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心分離培養(yǎng)。

    1.2 試驗(yàn)儀器 PCR擴(kuò)增儀(上海依科賽生物制品有限公司),超凈工作臺(tái)(蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司),凝膠成像儀(上海依科賽生物制品有限公司),超純水系統(tǒng)(優(yōu)普)1.3 試驗(yàn)試劑 細(xì)菌微量生化鑒定管(北京陸橋技術(shù)股份有限公司),藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),BstDNA鏈置換聚合酶及緩沖液Buffer(美國(guó)紐英倫生物技術(shù)),細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司出品),SYBER Green I核酸染料(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 細(xì)菌DNA的提取 利用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,對(duì)待測(cè)菌株的新鮮純培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌總DNA 提?。ò凑f(shuō)明書(shū)操作)。

    2.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)合成 NCBI上公布的嗜水氣單胞菌pilin基因序列設(shè)計(jì)引物,利用在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)完成(表1)。設(shè)計(jì)好的引物提交華大公司進(jìn)行合成。

    2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立 外引物的反應(yīng)濃度為5 pmol,內(nèi)引物的濃度為40 pmol,環(huán)引物的濃度為40 pmol。緩沖液的濃度為2.5 mol/L,鎂離子的濃度為150 mmol/L,dNTP的濃度為10 mmol/L,BstDNA鏈置換聚合酶的濃度為8 U,模板為2 μL,補(bǔ)加去離子水至25 μL(表2)。63.5 ℃水浴鍋孵育,然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    表1 嗜水氣單胞菌(Ah-1)LAMP引物序列

    表2 LAMP方法的反應(yīng)體系

    2.4 LAMP反應(yīng)的特異性分析 利用設(shè)計(jì)合成的LAMP引物為模板;同時(shí)利用殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌其他3種單胞菌作為模板檢測(cè)LAMP引物的特異性。同時(shí),設(shè)置以ddH2O為模板的陰性對(duì)照。

    2.5 LAMP反應(yīng)的靈敏性分析 利用外引物F3和B3,擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的Pilin基因。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后,用ND2000超微量核酸分析儀測(cè)其DNA濃度。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)鶆蛳♂尦?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10。 分 別 用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的 DNA 為模板,并設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照。進(jìn)行LAMP靈敏性試驗(yàn)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 LAMP方法的特異性 利用嗜水氣單胞菌的Pilin基因設(shè)計(jì)的LAMP引物進(jìn)行特異性分析。Pilin引物能夠特異性擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的靶基因見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照均沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,表明引物特異性良好。

    圖1 嗜水氣單胞菌(Ah-1)LAMP方法的特異性

    結(jié)果顯示:嗜水氣單胞菌株反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性(+),肉眼觀察反應(yīng)物呈黃色。殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌等3株其他對(duì)照菌株反應(yīng)為陰性(-),反應(yīng)物呈橙色(染料本身的顏色);ddH2O對(duì)照亦是陰性(-)。說(shuō)明嗜水氣單胞菌LAMP方法的特異性良好。

    3.2 LAMP方法的靈敏性 利用ND2000核酸分析儀檢測(cè)Pilin的原始DNA濃度。對(duì)DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋以后,分別用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的DNA為模板,進(jìn)行LAMP反應(yīng),然后檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖2 嗜水氣單胞菌(Ah-1)LAMP方法的靈敏性

    結(jié)果顯示,在63.5 ℃的恒溫條件下,嗜水氣單胞菌最小檢出濃度是10-6ng/μL。

    3.3 討論 嗜水氣單胞菌是細(xì)鱗魚(yú)馴養(yǎng)繁育中的高發(fā)致病菌,一旦發(fā)病,難以根治,經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失。在細(xì)鱗魚(yú)的人工馴養(yǎng)中,迫切需要一種快捷、簡(jiǎn)便的方法對(duì)病源菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的診斷,用于疫病的早期預(yù)防和治療。

    本研究將LAMP技術(shù)運(yùn)用到嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)中來(lái)。篩選嗜水氣單胞菌的Pilin基因設(shè)計(jì)特異性L(fǎng)AMP引物,在63.5 ℃的恒溫條件下,嗜水氣單胞菌的最小檢出濃度分別為是10-6ng/μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方法特異性好,靈敏度高,可將病源的檢測(cè)時(shí)間控制在1 d以?xún)?nèi)。該方法所需儀器簡(jiǎn)單,1臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能完成反應(yīng)。結(jié)果通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)沉淀的顏色即可進(jìn)行判定,特別適合基層疫病的快速診斷,具有非常實(shí)用的應(yīng)用價(jià)值。

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