miR-27a、miR-27b 和miR-378在不同豬種皮下脂肪中的差異表達研究

陶 璇，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，王 言，龔建軍，應三成，王 衛(wèi)，呂學斌

（1. 四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都610066；2. 成都大學肉類加工四川省重點實驗室，四川成都 610106）

miRNA是一類長度約22 個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，在細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等基本生物過程中起著重要作用，是基因表達的重要調控因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a和miR-27b在細胞中過表達能夠降低脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase，LPL)基因的表達量，進而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達[2-3]；miR-378在脂肪組織中影響脂肪的生成，在細胞中過表達可引起脂肪代謝基因表達上調[4-6]。脂肪組織不僅是動物機體能量儲存的一種形式，還參與調節(jié)包括食欲和能量消耗等多個機體功能，且對繁殖、炎癥和免疫反應等多個復雜的生理過程也有重要調控作用[7]。研究豬的脂肪代謝不僅有利于改善其胴體和肉質性能，還有助于推動人類肥胖和代謝性疾病的研究。

本研究采用QRT-PCR技術檢測了7個豬種背部皮下脂肪組織中miR-27a、miR-27b和miR-378的差異表達，以期為探明不同豬種脂肪沉積能力及肉質差異形成的分子機制提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗豬均由四川省畜牧科學研究院種豬科研基地提供。7個豬種包括引進豬種大約克夏豬和6個四川省地方豬種（丫杈豬、內江豬、青峪豬、雅南豬、成華豬、藏豬），每個豬種隨機選取3頭30日齡健康斷奶仔豬，共21頭，同一時間開始組建群體，相同品種同欄飼養(yǎng)，采用相同的營養(yǎng)水平和飼喂方式，達到6月齡進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對應處的背部皮下脂肪組織和背最長肌。

1.2 實驗方法

1.2.1 表型指標測定 瘦肉率、平均背膘厚按《豬胴體性狀測定技術規(guī)范》（NY/T 825-2004）的方法測定并計算，單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量按《肉與肉制品脂肪酸測定》（GB/T 9695.2-2008）的方法測定。

1.2.2 總RNA提取和QRT-PCR 脂肪組織的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen， China)的操作說明書提取，QRT-PCR 采用 miScript ⅠⅠ RT Kit （Qiagen，China）根據(jù)操作說明將RNA轉錄成cDNA，采用miScript SYBR?Green PCR Kit （Qiagen，China） 在 CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進行熒光定量檢測，每個反應體系20 μL。5S、18S和U6作為miRNA定量的內參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA定量結果均通過熔解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每個樣本重復3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SigmaPlot 12.5軟件對性狀指標和基因相對表達量進行統(tǒng)計分析（ANVOA），結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 胴體及肉質性狀測定 由表2可知，在7個豬種中，大約克夏豬瘦肉率最高，丫杈豬其次，青峪豬最低，6個地方豬種之間的瘦肉率差異不顯著（P＞0.05），但均極顯著低于大約克夏豬（P＜0.01）；大約克夏豬平均背膘厚最小，雅南豬其次，內江豬最大，大約克夏豬平均背膘厚顯著或極顯著小于雅南豬（P＜0.05）、內江豬和藏豬（P＜0.01），6個地方豬種中，雅南豬平均背膘厚顯著小于內江豬、青峪豬和藏豬（P＜0.05）；單不飽和脂肪酸含量丫杈豬最高，青峪豬其次，大約克夏豬最低，顯著低于除雅南豬之外的其余5個地方豬種（P＜0.05），6個地方豬種中，丫杈豬、青峪豬的單不飽和脂肪酸含量極顯著高于雅南豬（P＜0.01）；大約克夏豬的多不飽和脂肪酸含量極顯著高于地方豬種（P＜0.01），6個地方豬種間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 引物信息表

表2 不同豬種相關胴體及肉質性狀測定結果

2.2 3種miRNA的表達水平 由圖1可知，大約克夏豬miR-27a相對表達量顯著高于丫杈豬、雅南豬、藏豬（P＜0.05），極顯著高于內江豬、青峪豬、成華豬（P＜0.01）；6個地方豬種間miR-27a相對表達量差異不顯著（P＞0.05），其中雅南豬最高，內江豬最低；大約克夏豬miR-27b、miR-378相對表達量均極顯著高于6個地方豬種（P＜0.01）；地方豬種中，雅南豬miR-27b、miR-378相對表達量最高，丫杈豬miR-27b相對表達量最低，成華豬和內江豬miR-378相對表達量最低；雅南豬miR-27b相對表達量顯著高于丫杈豬和內江豬（P＜0.05），青峪豬、雅南豬、成華豬與藏豬這4個地方豬種間的miR-27b相對表達量差異不顯著（P＞0.05），地方豬種間miR-378相對表達量差異也不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同豬種背部皮下脂肪miR-27a、miR-27b、miR-378表達水平

2.3 3種miRNA的表達水平與胴體、肉質相關性狀的相關性 由表 3可知，miR-27a、miR-27b、miR-378在背部皮下脂肪中的表達水平與瘦肉率、多不飽和脂肪酸含量均呈極顯著正相關（P＜0.01），與平均背膘厚呈負相關（P＞0.05）；miR-27b在背部皮下脂肪中的表達水平與單不飽和脂肪酸含量呈顯著負相關（P＜0.05），miR-27a、miR-378在背部皮下脂肪中的表達水平均與單不飽和脂肪酸含量呈負相關（P＞0.05）。

3 討 論

為探明豬脂肪沉積性狀相關基因或調控因子差異表達的分子遺傳機理，近年來育種學家已在豬脂肪沉積的調控機理方面做了大量研究[8-10]，但這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究的深入，從轉錄后的miRNA水平探索豬脂肪沉積形成的分子機理成為研究熱點。胴體瘦肉率是評價胴體品質的主要指標，而脂肪是影響豬經濟價值和肉質風味的重要因素[11-12]。本研究中6個地方豬種屬脂肪型豬種，脂肪沉積多，其胴體瘦肉率極顯著低于大約克夏豬，多不飽和脂肪酸含量顯著低于大約克夏豬，單不飽和脂肪酸含量除雅南豬外則均顯著高于大約克夏豬。這說明地方豬種肉質優(yōu)良，口感風味俱佳，是培育優(yōu)質風味豬的優(yōu)良素材。

miRNA在豬脂肪形成過程中起著重要的調節(jié)作用[13-14]。miR-27在脂肪細胞分化、代謝和脂肪形成中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。研究表明，miR-27a和miR-27b與LPL基因的表達有關，在細胞中miR-27過表達能夠降低LPL基因的表達量，并抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成；同時，miR-27a和miR-27b還可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ、視黃醛X受體α、脂聯(lián)素、脂肪酸結合蛋白4和葡萄糖轉運蛋白4等脂代謝相關基因的表達[14]，加速甘油三酯水解[15]。miR-378則可以增強脂肪酸結合蛋白4、FAS和硬脂酰輔酶A脫氫酶（SCD-1）等脂肪酸代謝相關基因的表達[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，大約克夏背部皮下脂肪中3種miRNA表達水平均顯著高于6個地方豬種；6個地方豬種背部皮下脂肪中miR-27a、miR-378相對表達量均為雅南豬最高；相關性分析顯示，3種miRNA相對表達量均與瘦肉率和多不飽和脂肪酸呈極顯著正相關。以上說明這3種miRNA可抑制豬脂肪沉積，促進多不飽和脂肪酸生成，這與外種豬比地方豬脂肪沉積能力強、肉質易酸敗的生物學特性相一致。本研究結果可為闡明豬脂肪代謝和肉品質形成的分子機理提供基礎數(shù)據(jù)，并為優(yōu)質風味豬育種提供新的研究思路。

表3 miR-27a、miR-27b、miR-378與胴體、肉質相關性狀的相關性分析