基于高通量測序技術(shù)的美洲獾腸道微生物多樣性分析

王志永 吳曉陽 張永賓

(1.石家莊市動物園管理處，石家莊，050200；2.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，曲阜，273100)

鼬科(Mustelidae)動物是食肉目(Carnivora)中第一大科，包括25屬，近70種動物，大部分的獾類在我國都有分布，為我們的珍稀野生動物保護(hù)提供了較為便利的數(shù)據(jù)來源。其中美洲獾屬(Taxidea)同樣屬于鼬科，但是在中國卻沒有自然分布，為了更好地對鼬科動物進(jìn)行整體數(shù)據(jù)的采集，我們需要對其進(jìn)行數(shù)據(jù)的補(bǔ)充。美洲獾屬屬于鼬科、美洲獾亞科(Taxidiinae)。只包括1個種——美洲獾(Taxideataxus)，主要分布于北美洲中部和西南部的開闊草原、耕地和稀樹草原。善捕食草原害鼠，對草原鼠害的控制起著無可替代的作用，但其習(xí)性又能破壞草場和農(nóng)田。近年來由于人類活動和過度狩獵導(dǎo)致其種群數(shù)量明顯下降，現(xiàn)已列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》(IUCN)ver 3.1：2008年哺乳綱紅色名錄低危(LC)。為了制止美洲獾數(shù)量的日益減少，需要對其進(jìn)行保護(hù)。眾所周知，腸道菌群對宿主的健康具有重要的作用，美洲獾同樣如此。美洲獾的腸道環(huán)境是機(jī)體非常重要的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物對美洲獾的消化、免疫等功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。機(jī)體中的大多數(shù)部位都存在著一定數(shù)量的微生物，而腸道中的微生物因位置敏感生物多樣性較高被人們廣泛關(guān)注[2-3]。美洲獾腸道菌群多樣性的探究方法非常多，早期主要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，但腸道中的微生物大多數(shù)都是無法被分離培養(yǎng)的，傳統(tǒng)方法無法探究[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了如末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等方法，這些方法雖然能將一些厭氧菌識別出來，但研究技術(shù)的局限及小通量的數(shù)據(jù)使得我們無法獲得較多的信息量，也無法更進(jìn)一步地探究[5-7]。19世紀(jì)80年代以來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，該技術(shù)以其高通量、高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)被廣大微生態(tài)科學(xué)家青睞[8]。近年來，高通量技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于水體、土壤及糞便微生物研究中。但是，在國內(nèi)利用高通量測序技術(shù)對健康美洲獾腸道微生物的研究實(shí)屬罕見。本研究通過Illumina MiSeq平臺進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA的V4高變區(qū)進(jìn)行雙端測序，快速、全面地鑒定健康美洲獾腸道微生物，為研究美洲獾腸道微生物的結(jié)構(gòu)與其在腸道中的功能提供參考依據(jù)，為世界范圍內(nèi)的鼬科動物保護(hù)提供了可靠的理論支持。

1 材料與方法

1.1 腸道菌群基因序列的獲取

美洲獾的腸道菌群高通量數(shù)據(jù)從NCBI網(wǎng)站下載，所有序列以FASTQ文件格式保存。對5個個體重新編號為MZH1-MZH5。美洲獾的新鮮糞便樣本來自于美國某動物園，其食物為常規(guī)飼養(yǎng)飼料，采樣前并未進(jìn)食任何影響腸道菌群的抗生素等藥物。測序采用Illumina MiSeq高通量平臺進(jìn)行雙端測序。

1.2 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對每個樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)；拼接得到的Raw Tags，需要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime(V1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行如下操作：a)Tags截?。簩aw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截斷；b)Tags長度過濾：Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理后得到的Tags需要進(jìn)行去除嵌合體序列(http：//www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html)的處理，Tags序列通過(UCHIME Algorithm，http：//www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)與數(shù)據(jù)庫(Gold database，http：//drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http：//drive5.com/uparse/)對所有樣品的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時會選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA(http：//www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平：kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使用Mothur軟件計(jì)算Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列及OTUs

本研究基于Illumina高通量測序技術(shù)對5只健康美洲獾腸道菌群16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行測序，按照97%的閾值對OTUs進(jìn)行歸類，共獲得140922條tags，平均tags為(27964±757)條，并歸類于80個OTUs。其中，有效序列數(shù)量最高的是樣品MZH5，最低的是MZH3，相差1661條。

2.2 Alpha多樣性分析

采用Alpha多樣性指數(shù)對各樣品的豐富度和多樣性進(jìn)行比較。從圖1可以看出，稀釋曲線隨著測試深度的不斷增加逐漸上升，并趨于平緩，說明測序深度較為合理，雖然大多數(shù)菌群被覆蓋，但仍有少量細(xì)菌未被測出。

Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明(表1)，美洲獾的菌群物種豐富度和多樣性都相對較高。其中，樣品中菌群豐富度指數(shù)較高的為MZH1和MZH2(Ace：321.4，334.1和Chaol：209.3，179.5)，最低的為MZH4(Ace值131.4和Chaol值110.9)。同時我們對5個樣品的菌群多樣性也進(jìn)行了分析。Shannon指數(shù)越大表示群落多樣性越高，MZH3的Shannon值最大0.59，最低的為0.56。但是多樣性指數(shù)Simpson值各樣品之間相差不大。Coverage指數(shù)是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率，5個樣品的Coverage均在99.8%以上，表明樣品中序列未被檢測到的可能性較低。

表1 美洲獾腸道菌群多樣性指數(shù)

Tab.1 The microbiome diversity index of American badger

2.3 物種注釋

在門水平和屬水平對樣品進(jìn)行物種注釋分析。15個樣品共獲得所有樣品共含有10個菌門，74個菌屬。此外，還有大量的無法鑒別菌群的序列。

在門水平上，含量大于1%有5個菌門，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)，平均含量為73.01%；擬桿菌門(Bacteroidetes)，平均含量為9.31%；變形菌門(Proteobacteria)，平均含量為7.44%；放線菌門(Actinobacteria)，平均含量為3.08%；疣微菌門(Verrucomicrobia)，平均含量為1.66%。屬水平含量大于1%的菌屬共有21個，其中梭菌屬系列(Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XI、Clostridium_IV、Clostridium_XIVb、Clostridium_XIVa、Clostridium_XVIII)，平均含量為19.82%；鏈球菌屬(Streptococcus)，平均含量為4.59%；Cellulosilyticum，平均含量為3.31%；普氏菌屬(Prevotella)，平均含量為2.65%；Butyricicoccus，平均含量為2.40%；瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，平均含量為1.89%；不動桿菌屬(Acinetobacter)，平均含量為1.71%；乳酸菌屬(Lactobacillus)，平均含量為1.45%；Hespellia，平均含量為1.23%；平均含量為1.20%的菌屬有：變形桿菌屬(Proteus)、Akkermansia、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、Lachnospiracea_incertae_sedis、Turicibacter。

3 討論

對健康美洲獾的腸道菌群開展的高通量測序結(jié)果表明：5只健康美洲獾的腸道菌群的種類和數(shù)量不完全相同，可能的原因是美洲獾的體質(zhì)、肥胖程度及飲食量等差異造成。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種，測試結(jié)果具有一定的隨機(jī)性。研究表明，腸道菌群的豐富度和多樣性與年齡和性別也有關(guān)系，所以其年齡和性別也可能是造成差異的原因[9]。即使在相同飼養(yǎng)環(huán)境下，也會存在個體差異。本次研究檢測結(jié)果覆蓋了大多數(shù)的菌種，所以本次試驗(yàn)具有較好的代表性。

通過物種注釋可以看出，含量排在前五的門分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和疣微菌門，與其他鼬科動物腸道菌群的研究結(jié)果相似[10]。共享核心菌群比較結(jié)果顯示，除疣微菌門外，其他菌門都是共享核心菌門。厚壁菌門是健康美洲獾的腸道中含量最多的菌群。厚壁菌門在腸道或糞便中作為主要菌門在貓、狗、馬等動物中也有報道。據(jù)報道，厚壁菌門與脂肪、蛋白的消化有關(guān)，美洲獾作為以嚙齒動物和其他小型哺乳動物為食主要食物的獸類，厚壁菌門對其營養(yǎng)消化吸收有幫助作用[11-14]。不同個體門水平和屬水平上微生物百分比差異都較小。本次試驗(yàn)測得到的菌種與紫貂(Marteszibellina)等的結(jié)果存在差異，造成差異的原因除飼養(yǎng)環(huán)境、品種和研究方法不同外，也可能是飼糧配方不同造成的差異[8]。研究表明，飲食差異對動物的健康和代謝有影響，而且可以改變動物的腸道微生物。本實(shí)驗(yàn)所測樣品數(shù)較少，要總結(jié)出美洲獾腸菌群變化的詳細(xì)規(guī)律，以及在不同生長階段中發(fā)揮的作用有無變化等，還有待進(jìn)一步研究。