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    基于高通量測序技術(shù)的美洲獾腸道微生物多樣性分析

    2018-11-23 03:04:42王志永吳曉陽張永賓
    野生動物學(xué)報 2018年4期
    關(guān)鍵詞:厚壁美洲高通量

    王志永 吳曉陽 張永賓

    (1.石家莊市動物園管理處,石家莊,050200;2.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,曲阜,273100)

    鼬科(Mustelidae)動物是食肉目(Carnivora)中第一大科,包括25屬,近70種動物,大部分的獾類在我國都有分布,為我們的珍稀野生動物保護(hù)提供了較為便利的數(shù)據(jù)來源。其中美洲獾屬(Taxidea)同樣屬于鼬科,但是在中國卻沒有自然分布,為了更好地對鼬科動物進(jìn)行整體數(shù)據(jù)的采集,我們需要對其進(jìn)行數(shù)據(jù)的補(bǔ)充。美洲獾屬屬于鼬科、美洲獾亞科(Taxidiinae)。只包括1個種——美洲獾(Taxideataxus),主要分布于北美洲中部和西南部的開闊草原、耕地和稀樹草原。善捕食草原害鼠,對草原鼠害的控制起著無可替代的作用,但其習(xí)性又能破壞草場和農(nóng)田。近年來由于人類活動和過度狩獵導(dǎo)致其種群數(shù)量明顯下降,現(xiàn)已列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》(IUCN)ver 3.1:2008年哺乳綱紅色名錄低危(LC)。為了制止美洲獾數(shù)量的日益減少,需要對其進(jìn)行保護(hù)。眾所周知,腸道菌群對宿主的健康具有重要的作用,美洲獾同樣如此。美洲獾的腸道環(huán)境是機(jī)體非常重要的微生態(tài)系統(tǒng),腸道微生物對美洲獾的消化、免疫等功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。機(jī)體中的大多數(shù)部位都存在著一定數(shù)量的微生物,而腸道中的微生物因位置敏感生物多樣性較高被人們廣泛關(guān)注[2-3]。美洲獾腸道菌群多樣性的探究方法非常多,早期主要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法,但腸道中的微生物大多數(shù)都是無法被分離培養(yǎng)的,傳統(tǒng)方法無法探究[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,出現(xiàn)了如末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)等方法,這些方法雖然能將一些厭氧菌識別出來,但研究技術(shù)的局限及小通量的數(shù)據(jù)使得我們無法獲得較多的信息量,也無法更進(jìn)一步地探究[5-7]。19世紀(jì)80年代以來,高通量測序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn),該技術(shù)以其高通量、高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)被廣大微生態(tài)科學(xué)家青睞[8]。近年來,高通量技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于水體、土壤及糞便微生物研究中。但是,在國內(nèi)利用高通量測序技術(shù)對健康美洲獾腸道微生物的研究實(shí)屬罕見。本研究通過Illumina MiSeq平臺進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA的V4高變區(qū)進(jìn)行雙端測序,快速、全面地鑒定健康美洲獾腸道微生物,為研究美洲獾腸道微生物的結(jié)構(gòu)與其在腸道中的功能提供參考依據(jù),為世界范圍內(nèi)的鼬科動物保護(hù)提供了可靠的理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 腸道菌群基因序列的獲取

    美洲獾的腸道菌群高通量數(shù)據(jù)從NCBI網(wǎng)站下載,所有序列以FASTQ文件格式保存。對5個個體重新編號為MZH1-MZH5。美洲獾的新鮮糞便樣本來自于美國某動物園,其食物為常規(guī)飼養(yǎng)飼料,采樣前并未進(jìn)食任何影響腸道菌群的抗生素等藥物。測序采用Illumina MiSeq高通量平臺進(jìn)行雙端測序。

    1.2 數(shù)據(jù)分析

    根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對每個樣品的reads進(jìn)行拼接,得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags);拼接得到的Raw Tags,需要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime(V1.7.0,http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程,進(jìn)行如下操作:a)Tags截?。簩aw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截斷;b)Tags長度過濾:Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集,進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理后得到的Tags需要進(jìn)行去除嵌合體序列(http://www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html)的處理,Tags序列通過(UCHIME Algorithm,http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)與數(shù)據(jù)庫(Gold database,http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對檢測嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)對所有樣品的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),同時會選取OTUs的代表性序列,依據(jù)其算法原則,篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋,用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8~1),獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平:kingdom(界),phylum(門),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使用Mothur軟件計(jì)算Chao1,Shannon,Simpson,ACE,Goods-coverage指數(shù),使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品序列及OTUs

    本研究基于Illumina高通量測序技術(shù)對5只健康美洲獾腸道菌群16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行測序,按照97%的閾值對OTUs進(jìn)行歸類,共獲得140922條tags,平均tags為(27964±757)條,并歸類于80個OTUs。其中,有效序列數(shù)量最高的是樣品MZH5,最低的是MZH3,相差1661條。

    2.2 Alpha多樣性分析

    采用Alpha多樣性指數(shù)對各樣品的豐富度和多樣性進(jìn)行比較。從圖1可以看出,稀釋曲線隨著測試深度的不斷增加逐漸上升,并趨于平緩,說明測序深度較為合理,雖然大多數(shù)菌群被覆蓋,但仍有少量細(xì)菌未被測出。

    Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明(表1),美洲獾的菌群物種豐富度和多樣性都相對較高。其中,樣品中菌群豐富度指數(shù)較高的為MZH1和MZH2(Ace:321.4,334.1和Chaol:209.3,179.5),最低的為MZH4(Ace值131.4和Chaol值110.9)。同時我們對5個樣品的菌群多樣性也進(jìn)行了分析。Shannon指數(shù)越大表示群落多樣性越高,MZH3的Shannon值最大0.59,最低的為0.56。但是多樣性指數(shù)Simpson值各樣品之間相差不大。Coverage指數(shù)是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率,5個樣品的Coverage均在99.8%以上,表明樣品中序列未被檢測到的可能性較低。

    表1 美洲獾腸道菌群多樣性指數(shù)

    Tab.1 The microbiome diversity index of American badger

    2.3 物種注釋

    在門水平和屬水平對樣品進(jìn)行物種注釋分析。15個樣品共獲得所有樣品共含有10個菌門,74個菌屬。此外,還有大量的無法鑒別菌群的序列。

    在門水平上,含量大于1%有5個菌門,分別為:厚壁菌門(Firmicutes),平均含量為73.01%;擬桿菌門(Bacteroidetes),平均含量為9.31%;變形菌門(Proteobacteria),平均含量為7.44%;放線菌門(Actinobacteria),平均含量為3.08%;疣微菌門(Verrucomicrobia),平均含量為1.66%。屬水平含量大于1%的菌屬共有21個,其中梭菌屬系列(Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XI、Clostridium_IV、Clostridium_XIVb、Clostridium_XIVa、Clostridium_XVIII),平均含量為19.82%;鏈球菌屬(Streptococcus),平均含量為4.59%;Cellulosilyticum,平均含量為3.31%;普氏菌屬(Prevotella),平均含量為2.65%;Butyricicoccus,平均含量為2.40%;瘤胃球菌屬(Ruminococcus),平均含量為1.89%;不動桿菌屬(Acinetobacter),平均含量為1.71%;乳酸菌屬(Lactobacillus),平均含量為1.45%;Hespellia,平均含量為1.23%;平均含量為1.20%的菌屬有:變形桿菌屬(Proteus)、Akkermansia、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、Lachnospiracea_incertae_sedis、Turicibacter。

    3 討論

    對健康美洲獾的腸道菌群開展的高通量測序結(jié)果表明:5只健康美洲獾的腸道菌群的種類和數(shù)量不完全相同,可能的原因是美洲獾的體質(zhì)、肥胖程度及飲食量等差異造成。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性,并間接反映樣品中物種的豐富程度,當(dāng)曲線趨向平坦時,說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理,更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種,測試結(jié)果具有一定的隨機(jī)性。研究表明,腸道菌群的豐富度和多樣性與年齡和性別也有關(guān)系,所以其年齡和性別也可能是造成差異的原因[9]。即使在相同飼養(yǎng)環(huán)境下,也會存在個體差異。本次研究檢測結(jié)果覆蓋了大多數(shù)的菌種,所以本次試驗(yàn)具有較好的代表性。

    通過物種注釋可以看出,含量排在前五的門分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和疣微菌門,與其他鼬科動物腸道菌群的研究結(jié)果相似[10]。共享核心菌群比較結(jié)果顯示,除疣微菌門外,其他菌門都是共享核心菌門。厚壁菌門是健康美洲獾的腸道中含量最多的菌群。厚壁菌門在腸道或糞便中作為主要菌門在貓、狗、馬等動物中也有報道。據(jù)報道,厚壁菌門與脂肪、蛋白的消化有關(guān),美洲獾作為以嚙齒動物和其他小型哺乳動物為食主要食物的獸類,厚壁菌門對其營養(yǎng)消化吸收有幫助作用[11-14]。不同個體門水平和屬水平上微生物百分比差異都較小。本次試驗(yàn)測得到的菌種與紫貂(Marteszibellina)等的結(jié)果存在差異,造成差異的原因除飼養(yǎng)環(huán)境、品種和研究方法不同外,也可能是飼糧配方不同造成的差異[8]。研究表明,飲食差異對動物的健康和代謝有影響,而且可以改變動物的腸道微生物。本實(shí)驗(yàn)所測樣品數(shù)較少,要總結(jié)出美洲獾腸菌群變化的詳細(xì)規(guī)律,以及在不同生長階段中發(fā)揮的作用有無變化等,還有待進(jìn)一步研究。

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