深圳大鵬澳海域翡翠貽貝中麻痹性貝類毒素的含量特征及生物相關(guān)因子分析

王旭峰，陳海剛，莫夢(mèng)松，王強(qiáng)，黎智廣，趙東豪

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，廣州 510300)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)是一種分布廣泛的海洋生物毒素[1]，屬于四氫嘌呤衍生物[2]，毒性強(qiáng)烈，中國(guó)近海區(qū)域的消費(fèi)者因誤食被毒素污染的貝類產(chǎn)品引發(fā)嚴(yán)重的中毒或死亡事件時(shí)有發(fā)生。其毒素作用機(jī)理與河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)類似，通過抑制鈉離子通道的傳輸而影響神經(jīng)的傳導(dǎo)，使人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用[3-5]。研究證實(shí)，PSP來源于有毒赤潮中的產(chǎn)毒藻類，多種亞歷山大藻(Alexandrium)、鏈狀裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)和巴哈馬梨甲藻(Pyrodiniumbahamense)等均分泌產(chǎn)生毒素[6-7]。濾食性貝類攝食這些產(chǎn)毒藻類，使PSP在體內(nèi)蓄積，造成潛在的食用風(fēng)險(xiǎn)。鑒于PSP對(duì)于貝類食用安全的危害，美國(guó)和歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)都建立了各自相對(duì)完善的PSP監(jiān)測(cè)計(jì)劃、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警體系和管控措施。中國(guó)相關(guān)部門制定了一系列的貝類毒素衛(wèi)生質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和赤潮預(yù)警及有毒赤潮應(yīng)對(duì)措施，但是尚未建立起有效的PSP預(yù)警體系和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)規(guī)范[8]。近年來中國(guó)沿海區(qū)域貝類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增長(zhǎng)，生態(tài)環(huán)境破壞惡化加劇，海區(qū)水體經(jīng)常嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化，赤潮爆發(fā)次數(shù)越來越多，沿海區(qū)域貝類PSP污染情形越來越多[4-6,9-11]，引起了相關(guān)部門的高度重視。

南海海域是國(guó)內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖區(qū)，人們因食用含毒素貝類導(dǎo)致的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生，已引起廣泛關(guān)注。江天久等[8]對(duì)深圳海域貝類中PSP含量調(diào)查表明，染毒貝類的檢出率較高，認(rèn)為南海海域?qū)儆赑SP的高發(fā)區(qū)域。冷科明等[6]采用小鼠生物法測(cè)定珠江口海域(珠江口、大鵬灣和大亞灣)貝類中的PSP，檢出的毒素含量普遍偏低。大鵬澳屬于開放性海域，與外海水體交換暢通，適宜經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖，其中翡翠貽貝(Pernaviridis)又是易蓄積PSP的雙殼貝類。為了調(diào)查該海域PSP的污染水平，研究浮游植物潛在產(chǎn)毒藻的種類、豐度變化情況與翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量的相關(guān)性，于2017年8月至2018年4月在大鵬澳海域每月定期采集翡翠貽貝和浮游植物樣品，測(cè)定石房蛤類毒素(saxitoxin，STX)、膝溝藻類毒素(gonyautoxin，GTX)和N-磺酰氨甲酰基類毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)等13種PSP的含量，鑒定浮游植物的種類和豐度。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的PSP檢測(cè)方法主要有小鼠生物法(MBA)[12]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[13-14]、液相色譜法-熒光法(HPLC-FLD)[15-17]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[18-23]等。小鼠生物法作為AOAC推薦的PSP半定量分析方法，是唯一被大多數(shù)國(guó)家普遍接受和廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有毒性反應(yīng)直接、可靠的優(yōu)點(diǎn)，但無法區(qū)分樣品中的PSP種類[12]。ELISA法往往缺乏對(duì)所有毒素組分特異性強(qiáng)的抗體[13-14, 18]。HPLC-FLD法需要衍生化反應(yīng)，且難以排除假陽(yáng)性結(jié)果的干擾[15-16, 19]。LC-MS/MS法近年來以定性定量準(zhǔn)確的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于PSP的檢測(cè)。本研究采用石墨化碳黑固相萃取小柱凈化提取液，減少樣品稀釋倍數(shù)，經(jīng)超高效液相色譜分離，11 min內(nèi)完成樣品測(cè)定，方法操作簡(jiǎn)單快速、靈敏可靠。通過研究PSP的含量變化與潛在產(chǎn)毒藻的種類、數(shù)量之間的關(guān)系，為相關(guān)部門完善和強(qiáng)化PSP監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

在大鵬澳海域設(shè)置SZ1、SZ2和SZ3共3個(gè)采樣點(diǎn)(圖1)，從2017年8月至2018年4月，每月中旬同時(shí)采集水樣、浮游植物和翡翠貽貝等樣品。

表層水樣：樣品瓶預(yù)先用純水沖洗干凈，且不與金屬器件接觸，采樣前再用現(xiàn)場(chǎng)海水沖洗2次。將5 L水樣，用20 μm的玻璃纖維微孔濾膜(Φ47)抽濾，然后收集濾膜，自然風(fēng)干后，測(cè)定濾膜上固形物中PSP的含量。

浮游植物：按照GB17378.7—2007[24]中規(guī)定的方法，用淺水Ⅲ型浮游生物網(wǎng)進(jìn)行底層至水面的垂直取樣。采集(～5 m)浮游植物樣品，經(jīng)中性甲醛溶液固定后，帶回實(shí)驗(yàn)室鑒定。

翡翠貽貝：挑選大小均一的翡翠貽貝，每個(gè)樣品不少于500 g，用海水沖洗干凈后，放入雙層聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-18 ℃以下冰凍保存。去殼后，將樣品再分為整貝、內(nèi)臟團(tuán)和其他可食組織3種樣品類型，分別用絞肉機(jī)制成肉泥狀，備用。

為比較不同貝類對(duì)PSP的蓄積能力差異，在設(shè)定站位附近也采集了近江牡蠣(Crassostrearivularis)樣品。去殼后，處理方法同翡翠貽貝。

圖1 貝類采樣站位圖Fig.1 Sampling stations for shellfish

1.2 儀器與試劑

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配備Masslynx V4.1控制軟件)，購(gòu)于美國(guó)Waters公司；5810臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；MS3旋渦混合器購(gòu)于德國(guó)IKA公司；去離子水發(fā)生器，購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；N-EVAP氮吹儀，購(gòu)于美國(guó)Organomation公司。

13種PSP的標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于加拿大國(guó)家研究委員會(huì)(NRC)；甲酸、乙腈及乙酸銨為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；石墨化碳黑固相萃取柱(250 mg，3 cc)，購(gòu)于天津博納艾杰爾科技有限公司；0.22 μm尼龍66注射式濾器，購(gòu)于天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；20 μm玻璃纖維微孔濾膜，購(gòu)于英國(guó)Whatman公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；其他未做說明的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于廣州市化學(xué)試劑廠。

1.3 樣品前處理

稱取(5.00±0.05) g貝類樣品，風(fēng)干的浮游植物樣品同濾膜稱重后全部剪碎(去除濾膜的重量)，置于50 mL聚丙烯離心管中，再加入5 mL 2%乙酸水溶液，100 ℃水浴條件下提取10 min，待樣品冷卻后，8 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至15 mL聚丙烯離心管，待凈化。

石墨碳黑固相萃取柱使用前先用3 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液和3 mL 0.1%氨水平衡。準(zhǔn)確移取1 mL提取液，加入5 μL氨水混合均勻，上柱，然后用3 mL純水淋洗小柱，1 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液洗脫。收集洗脫液，用乙腈稀釋至2 mL，12 000 r/min高速冷凍離心15 min，吸取上清液過0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 儀器測(cè)定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.35 mL/min；流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(A)和5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(B)。梯度洗脫程序：0～8.0 min，10%～90% B；8.0～8.5 min，90% B；8.5～9.0 min，90%～10% B；9.0～11 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離(ESI)，正、負(fù)離子掃描；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量850 L/hr；碰撞氣流速0.20 mL/min，錐孔反吹氣流量150 L/hr；監(jiān)測(cè)方式為多時(shí)段-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple-period MRM)。

表1 13種PSP的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 MRM parameters of 13 PSP

注：帶*為定量離子(Quantitative ion)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣及浮游植物中未測(cè)出PSP

現(xiàn)場(chǎng)用多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀測(cè)定海水的溫度、鹽度、pH和溶解氧等水質(zhì)指標(biāo)。冬季測(cè)得的最低水溫為11.5 ℃，夏季時(shí)最高達(dá)31.2 ℃。鹽度為30.5～34.1，大鵬澳海域與外海暢通，鹽度變化較小，降水較多的月份，鹽度會(huì)隨之降低，大多月份維持在33～34。pH值為7.71～8.03，溶解氧為3.24～11.43 mg/L。水質(zhì)樣品采用固相萃取法處理，未檢出PSP，可能是海水中的毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于方法檢測(cè)限所致。水樣用隔膜真空泵經(jīng)玻璃纖維微孔濾膜抽濾，收集濾膜上的浮游植物，測(cè)定PSP含量，所有月份的樣品均未檢出，結(jié)合浮游植物的鑒定結(jié)果，可能與產(chǎn)PSP的甲藻豐度太低有關(guān)。此外，海水抽濾后獲取的浮游植物樣品較少，也是浮游植物樣品中難以檢出PSP含量的另一原因。

2.2 翡翠貽貝樣品檢測(cè)結(jié)果

從2017年8月至2018年4月，每月中旬采樣1次，共采集翡翠貽貝樣品11次，2017年8—11月均未檢出毒素。12月由于檢出了PSP，在元旦前后加密了翡翠貽貝的采樣頻次。開殼前，首先測(cè)定翡翠貽貝的生物學(xué)指標(biāo)。不同月份翡翠貽貝的生長(zhǎng)情況不同，8～12月份采集的翡翠貽貝樣品個(gè)體較大，殼體最長(zhǎng)達(dá)8.5 cm;1～2月采集的翡翠貽貝樣品較小，長(zhǎng)度約3.3 cm，體重為4.5～21.0 g。

2017年12月至2018年3月采集的翡翠貽貝樣品，檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等，共8種PSP，每種毒素的含量為2.12 ～ 354.55 μg/kg，這可能與冬季時(shí)該海域的水溫比較適宜分泌PSP的有毒藻生長(zhǎng)有關(guān)。按照國(guó)際慣例，STX毒素的毒性因子被設(shè)為1，其他各種毒素按照其相對(duì)于STX的毒性大小來確定毒性因子(表2)，樣品中每種貝類毒素的毒力按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STX的毒力當(dāng)量來表示。將每個(gè)樣品檢出的不同種類PSP含量轉(zhuǎn)換為STX毒力當(dāng)量，則翡翠貽貝蓄積的PSP的毒力當(dāng)量為0.93～220.90 μg/kg(PSP的毒力以STX的毒力當(dāng)量計(jì)，全文同)(表3)。

表2 PSP毒性因子[25]Tab.2 Toxicity factors of PSP

表3 大鵬澳翡翠貽貝樣品中PSP的檢出含量Tab.3 Detected content of PSP in Perna viridis samples in monitor sites of Dapeng Bay n=3

注：“—”示未檢出。毒素含量數(shù)值以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

為比較翡翠貽貝與其他貝類對(duì)PSP的富集能力，在采集翡翠貽貝樣品時(shí)，同時(shí)在設(shè)定站位附近也采集了近江牡蠣樣品。檢測(cè)結(jié)果顯示，翡翠貽貝與近江牡蠣蓄積的PSP種類相同，但前者蓄積的毒素含量明顯高于后者，說明翡翠貽貝比近江牡蠣更易蓄積PSP。通常情況下，貽貝等雙殼貝類對(duì)PSP不敏感，藻類毒素對(duì)其攝食行為影響較小，其體內(nèi)容易蓄積較高濃度水平的毒素；相反，牡蠣對(duì)PSP高度敏感，當(dāng)藻類中毒素含量較高時(shí)，其會(huì)產(chǎn)生減少貝殼開合、選擇性濾食等生理反應(yīng)，以減少毒素的暴露。因此，與貽貝相比，相同環(huán)境條件下，牡蠣中PSP的含量往往較低[26]。

為了解貝體中不同部位的毒素含量，將去殼后的每個(gè)翡翠貽貝樣品，再分為整貝、內(nèi)臟團(tuán)和其他可食性組織3種樣品類型，分別測(cè)定PSP的含量。結(jié)果顯示，內(nèi)臟團(tuán)中PSP含量明顯高于貝體其他可食性組織，與其他人的研究結(jié)果一致[27-28]，所有檢出PSP的樣品的PSP的含量從高到低為：內(nèi)臟團(tuán)>整貝>其他可食性組織。貽貝為濾食性貝類，其體內(nèi)的PSP為外源性毒素，通過濾食含毒的藻類而蓄積獲得，因此其內(nèi)臟團(tuán)中的毒素含量最高。

2.3 浮游植物鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間共采集的7次浮游植物樣品，按照GB17378.7—2007[24]中規(guī)定的方法進(jìn)行鑒定，優(yōu)勢(shì)藻均為中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、柔弱角毛藻(ChaetocerosdebilisCleve)和柔弱菱形藻(Nitzschiadelicatissima)等硅藻，占浮游植物樣品總量的90%以上，其他藻類種類少，豐度低。將每月采集的樣品，按前六種優(yōu)勢(shì)藻出現(xiàn)的頻次作圖，結(jié)果見圖2，中肋骨條藻等的出現(xiàn)頻次最高，大多數(shù)月份均為第一或第二優(yōu)勢(shì)藻。

圖2 大鵬澳優(yōu)勢(shì)藻出現(xiàn)頻次(2017年9月—2018年3月)Fig.2 Frequency of dominant algae from Sep, 2017 to Mar, 2018 collected in Dapeng Bay

甲藻檢出較多的有具尾鰭藻(Dinophysiscaudata)、夜光藻(Noctilucascintillans)、大角角藻(Ceratiummacroceros)和叉角藻(Ceratiumfurca)等。夜光藻是主要的海洋赤潮發(fā)生藻之一，常分布于富營(yíng)養(yǎng)化的海區(qū)，具發(fā)光能力，可形成赤潮，對(duì)漁業(yè)危害很大，但其本身不含毒素，不產(chǎn)生PSP。2017年11月的浮游植物樣品，甲藻總量達(dá)10%(圖3)，但未檢測(cè)到能分泌產(chǎn)生PSP的亞歷山大藻、鏈狀裸甲藻和巴哈馬梨甲藻等。

2.4 浮游植物與貝類中PSP的相關(guān)性

2017年12月的翡翠貽貝樣品檢出了GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種PSP，含量最高為220.90 μg/kg(表3)。2018年1—2月仍從翡翠貽貝中檢出多種PSP，但含量迅速降至較低水平(圖4)，此時(shí)的甲藻數(shù)量較少，與之前的月份相當(dāng)。2018年3月從翡翠貽貝中僅檢出了GTX5，毒素含量為0.93～2.09 μg/kg，4月的樣品未檢出任何PSP組分。上述結(jié)果說明，大鵬澳翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量較低，且水體中被證明的能夠分泌產(chǎn)生PSP的甲藻數(shù)量也太少，故目前的研究結(jié)果尚無法揭示產(chǎn)毒藻的數(shù)量與貝類體內(nèi)PSP含量之間的相關(guān)性。

此外，具尾鰭藻可產(chǎn)生腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning toxins，DSP)，每月的浮游植物樣品均有檢出，預(yù)示著該海域的貝類可能會(huì)蓄積DSP，應(yīng)當(dāng)引起人們的注意。

本研究結(jié)果表明，大鵬澳翡翠貽貝中檢出的PSP種類多，但大多為毒性較低的毒素種類，采集樣品中最高毒性當(dāng)量為220.90 μg/kg，尚未達(dá)到歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)800 μg/kg。但結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室多年來對(duì)該海域貝類中PSP的監(jiān)測(cè)情況，認(rèn)為冬季仍有必要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)大鵬澳海域貝類中PSP的污染狀況。

圖3 大鵬澳海域不同月份甲藻占比Fig.3 Proportion of dinoflagellate in different months collected in Dapeng Bay

圖4 大鵬澳翡翠貽貝中PSP毒力的時(shí)間變化趨勢(shì)總毒力為該日月中檢出的PSP平均值。Fig.4 Change tendency of toxicity of PSP in different monitor months in Dapeng Bay Total toxicicity refers to the average value of detected PSP in mid-month.

3 結(jié)論

本研究調(diào)查了深圳大鵬澳翡翠貽貝中PSP的污染情況及浮游植物的種類、豐度。從2017年12月至2018年3月的翡翠貽貝樣品中共檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種毒素，每種毒素的質(zhì)量濃度為2.12～354.55 μg/kg，各個(gè)樣品PSP的含量為0.93～220.90 μg/kg。12月份樣品中PSP檢出種類最多，含量也最高。在浮游植物樣品采集期間，該海域的優(yōu)勢(shì)藻均為中肋骨條藻、柔弱角毛藻和柔弱菱形藻等硅藻，其他藻類種類少，豐度低。甲藻檢出較多的為具尾鰭藻、夜光藻等不產(chǎn)PSP的藻類，而塔瑪亞歷山大藻等產(chǎn)PSP的甲藻數(shù)量太少，且翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量總體較低，因此目前的研究結(jié)果尚無法揭示產(chǎn)毒藻的數(shù)量與貝類體內(nèi)PSP含量之間的相關(guān)性。樣品中檢出的PSP種類多，但大多為毒性較低的毒素種類。盡管翡翠貽貝中PSP的含量未達(dá)到歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)800 μg/kg，冬季仍需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)貝類中PSP含量。