LAIR1基因3’端非翻譯區(qū)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究

林輝 徐丹萍 諸溢揚(yáng) 鄭路亞

在我國(guó)，胃癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的前三位，且有明顯的地域差異。胃癌發(fā)病年齡集中在50歲以上人群，且男女發(fā)病率明顯失衡。人白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體 1（leukocyte-associated Ig-like receptor 1，LAIR1）幾乎表達(dá)于所有免疫細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞及肥大細(xì)胞等[1]。LAIR1的細(xì)胞質(zhì)尾有2個(gè)ITIM基序，體外研究表明LAIR1通過(guò)單克隆抗體與分子間的交聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞質(zhì)尾的ITIM基序的酪氨酸磷酸化，再招募SHP-1、SHP-2和Csk發(fā)揮免疫抑制功能[2]。查詢(xún)國(guó)外千人項(xiàng)目基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（IGSR）發(fā)現(xiàn)，中國(guó)西雙版納傣族與北京漢族人種LAIR1基因3’非翻譯區(qū)（3’UTR）單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)基因型分布頻率存在明顯差異。而本研究對(duì)胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率進(jìn)行分析，以探討其與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014年10月至2015年9月在本院經(jīng)胃鏡下組織活檢確診的121例胃癌患者為胃癌組，其中男 91 例，女 30 例；年齡 30～87[64（57，71）]歲；腫瘤類(lèi)型：鱗癌1例，腺癌95例，印戒細(xì)胞癌4例，腺癌+印戒細(xì)胞癌20例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例。121例患者中92例接受胃癌根治術(shù)，明確腫瘤分化程度：中高分化41例，低分化51例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期58例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率為36.5%。選取同期本院收治且年齡、性別與胃癌患者匹配的126例慢性胃炎患者為對(duì)照組，均接受過(guò)胃鏡檢查，胃鏡下可見(jiàn)橢圓形、圓形潰瘍或糜爛，組織活檢結(jié)果為慢性胃炎；其中男94例，女32例；年齡 35～75[60（51，65）]歲。在 IGSR 查詢(xún)到傣族、北京漢族和南方漢族人種LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)詳細(xì)信息，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

表1 LAIR1基因3’UTR的6個(gè)SNP位點(diǎn)詳細(xì)信息

1.2 一代測(cè)序法檢測(cè)LAIR1基因3’UTR序列 取乙二胺四乙酸抗凝血，按照血液DNA抽提試劑盒操作說(shuō)明書(shū)（GK1072，100T，上海捷瑞生物工程有限公司）對(duì)外周血全基因組DNA進(jìn)行抽提。在保守區(qū)域設(shè)置引物，采用正向引物L(fēng)AIR1F-5′-CCCACAGTCCACAAAGCCCAT-3′，反向引物 LAIR1R-5′-TGAGATTCTGCCGCCTCCTAGT-3′對(duì) LAIR1 基因的 3’UTR 的 （19∶5355287-54355435）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1 212bp，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化，同時(shí)在中間段設(shè)置測(cè)序引物 LAIR1M-5′-TGCGTGGAGTAAAGCACAACCC-3′，采用一代測(cè)序儀（Applied Biosystems）進(jìn)行正向及中段測(cè)序。

1.3 序列比對(duì) 通過(guò)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)在19號(hào)染色體5355287-54355435位（LAIR1基因3’UTR）可查詢(xún)到267個(gè)SNP位點(diǎn)，兩組患者的測(cè)序結(jié)果采用序列比對(duì)工具BLAST進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)主要存在6個(gè)SNP位點(diǎn)，見(jiàn)表1和圖1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。胃癌組與對(duì)照組患者基因型及等位基因分布頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，并計(jì)算OR值及其95%CI來(lái)評(píng)估胃癌患者的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 LAIR1基因3’UTR的6個(gè)SNP位點(diǎn)的測(cè)序圖

2 結(jié)果

2.1 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 兩組患者LAIR1基因3’UTR的 6個(gè)SNP位點(diǎn)基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌組患者rs199714928位點(diǎn)G/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于對(duì)照組，G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 2～3。胃癌組 rs1054033 與 rs6509867 位點(diǎn)均存在完全單倍型連鎖現(xiàn)象，而對(duì)照組有16例存在不完全單倍型連鎖現(xiàn)象（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.2 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性與胃癌分化程度的關(guān)系 不同胃癌分化程度患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性位點(diǎn)基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點(diǎn)A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者，等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表5～6。不同性別、腫瘤類(lèi)型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布頻率比較[例（%）]

表3 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布頻率比較[例（%）]

表4 兩組患者LAIR1基因3'UTR區(qū)rs1054033與rs6509867等位基因連鎖比較[例（%）]

3 討論

LAIR1早在1997年就被克隆，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它被DX26抗體識(shí)別與結(jié)合后可抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能[3-5]。LAIR1是由287個(gè)氨基酸序列組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含了獨(dú)特的膜外C2型Ig樣區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)尾的2個(gè)ITIM基序[1,6]。根據(jù)分化抗原簇，LAIR1又被命名為CD305，在結(jié)構(gòu)上與其他定位在染色體19q13.4上的淋巴細(xì)胞受體復(fù)合物的抑制性Ig超家族成員相似。研究發(fā)現(xiàn)，LAIR1基因參與抑制粒細(xì)胞-單核細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞增殖，與膠原蛋白結(jié)合后強(qiáng)烈抑制GM-CSF介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加、磷酸化、AKT1/PKBα活化[7]。LAIR1基因的功能性配體是膠原蛋白，當(dāng)羥脯氨酸存在時(shí)具有高親和性。體外研究發(fā)現(xiàn)，不管是細(xì)胞系還是原發(fā)細(xì)胞中的膠原蛋白，與LAIR1基因結(jié)合均能直接抑制免疫細(xì)胞的生物學(xué)活性[8]。LAIR1基因廣泛表達(dá)且其周?chē)嬖诖罅颗潴w，因此必須調(diào)節(jié)LAIR1基因/膠原蛋白的相互反應(yīng)，從而確保免疫系統(tǒng)的平衡。一方面，作用于細(xì)胞的活化信號(hào)強(qiáng)度由LAIR1基因/膠原蛋白的交聯(lián)反應(yīng)來(lái)決定信號(hào)是否被抑制；另一方面，LAIR1基因表達(dá)水平?jīng)Q定其與膠原蛋白反應(yīng)的抑制水平。

表5 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系

表6 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系

目前關(guān)于LAIR1基因與實(shí)體瘤的關(guān)系研究較少。已有研究表明腫瘤患者血清可溶性LAIR1基因表達(dá)高于正常人，且外周血中NK細(xì)胞、CD4+及CD8+T細(xì)胞表面LAIR1基因表達(dá)明顯增加[9]。研究表明，宮頸癌組織及上皮卵巢癌組織LAIR1蛋白表達(dá)均高于正常癌旁組織，且與腫瘤大小、病理分期、臨床分級(jí)和淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)有關(guān)[10-11]。將LAIR1基因轉(zhuǎn)染到不表達(dá)LAIR1基因的Me-180細(xì)胞并使其穩(wěn)定表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)LAIR1蛋白會(huì)抑制細(xì)胞的增殖能力和抗凋亡能力[10]。然而，對(duì)表達(dá)LAIR1基因的HO-8910細(xì)胞進(jìn)行基因敲除并使其基因表達(dá)沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞侵襲能力反而增強(qiáng)[11]。

本研究對(duì)胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs199714928位點(diǎn)G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于慢性胃炎患者；但在中國(guó)西雙版納傣族人種（93例）中發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)全為純化子（G/G），與此位點(diǎn)祖先等位基因G一致，這表明rs199714928位點(diǎn)部分G突變成A可能是生物進(jìn)化的原因，以保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌的發(fā)生。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs1054033與rs6509867位點(diǎn)均存在完全的C-G和T-T單倍型連鎖現(xiàn)象，而慢性胃炎患者存在16例突破該連鎖現(xiàn)象的T-G單倍型?？梢?jiàn)，rs1054033與rs6509867位點(diǎn)出現(xiàn)T-G單倍型是一種保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌發(fā)生的現(xiàn)象。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點(diǎn)A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者，等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者；而不同性別、腫瘤類(lèi)型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，LAIR1基因3’UTR的rs199714928位點(diǎn)多態(tài)性可能是胃癌發(fā)生的易感因素；rs1054033與rs6509867位點(diǎn)存在不完全單倍型連鎖（T-G單倍型）可能是一種保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌發(fā)生的有利因素。