利用分子標(biāo)記輔助選育低谷蛋白水稻新品種

郭濤　王海鳳　薛芳　房文文　林香青　張士永

摘要：谷蛋白是水稻種子中含量最高的貯藏蛋白，占種子總蛋白的70%以上，是稻米蛋白中可供人體吸收的主要成分。但蛋白質(zhì)攝入過量會(huì)加重腎病和糖尿病患者的病情。低谷蛋白稻米可作為腎病患者的食療輔助品，減少患者蛋白攝入量，有效緩解病情。本研究通過引進(jìn)1份江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所低谷蛋白新種質(zhì)2054（材料種植編號(hào)HNG1），于2013 年配置其與優(yōu)良食味米水稻品種圣稻735的雜交組合，經(jīng)過4次回交，然后自交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，于2017年選育出1個(gè)低谷蛋白新品系17F2J3。經(jīng)過分子標(biāo)記檢測(cè)和種子總蛋白SDS-PAGE分析表明，這個(gè)家系谷蛋白含量均降至LGC-1水平，顯著低于圣稻735，且農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異，為黃淮稻區(qū)低谷蛋白水稻生產(chǎn)提供了優(yōu)良種質(zhì)材料。

關(guān)鍵詞：水稻；低谷蛋白；LGC-1基因；分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號(hào)：S511.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）08-0029-06

Breeding of Rice Varieties with Low Glutelin

Content by Molecular Marker-Assisted Selection

Guo Tao， Wang Haifeng， Xue Fang， Fang Wenwen， Lin Xiangqing， Zhang Shiyong

（Shandong Rice Research Institute/Shandong Rice Engineering Technology Research Center， Jinan 250100， China）

Abstract Glutelin is the most abundant storage protein in rice seeds，accounting for over 70% of the total seed protein. It is the main component of rice protein that can be absorbed by human body. But excessive protein intake can worsen the condition of patients with kidney disease and diabetes. Rice with low glutelin content can be used as functional food for patients with kidney disease， reducing the protein intake and effectively relieving the disease. In this research， the low glutelin content （LGC） improved rice variety 2054 named HNG1 was introduced from Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， and crossed with Shengdao 735 in 2013， a japonica variety with high eating quality in our lab. After consecutively four backcross using Shengdao 735 and then self-cross， in combination with molecular marker assisted selection， a new low-gluten line 17F2J3 was bred in 2017. Molecular marker detection and SDS-PAGE analysis showed that the glutelin content of the new strain was reduced to LGC-1 level and significantly lower than Shengdao 735. It would provide elite germplasms for low-glutelin rice production.

Keywords Rice； Low glutelin content； LGC-1 gene； marker-assisted selection

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物之一，我國(guó)60%以上人口以大米為主食。水稻種子蛋白質(zhì)含量占粒重的7%～10%，其中谷蛋白是最主要的儲(chǔ)藏蛋白，也是最容易被人體吸收的蛋白，約占稻米總蛋白的 60%以上[1]。因此提高谷蛋白含量能增加稻米中可吸收蛋白的含量，提升稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，對(duì)于腎臟病人和并發(fā)腎臟機(jī)能損害的糖尿病人來說，攝入過高的可吸收性蛋白會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致病情惡化[2]。近年來，隨著腎臟病人和并發(fā)腎臟機(jī)能損害的糖尿病患者人數(shù)不斷增加，低谷蛋白含量食品的市場(chǎng)需求越來越大。 為滿足這類病人的食譜要求， 培育低谷蛋白含量的品種已成為水稻育種的一個(gè)熱點(diǎn)[3]。

水稻種子中的蛋白質(zhì)，依據(jù)其溶解特性可分為4種：溶于水的清蛋白（albumins），溶于稀鹽溶液的球蛋白（globulins），溶于醇溶液的醇溶蛋白（prolamins）和溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白（glutelins）。 其中谷蛋白含量最高，占總貯藏蛋白的 60%～75%，醇溶蛋白次之，占20%～25%，還有少量的清蛋白和球蛋白[4]。谷蛋白由37～39 kD酸性亞基（α）和22～23 kD 堿性亞基（β）組成，在胚乳中以二型蛋白體（protein body Ⅱ， PB Ⅱ）形式存在。它首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成，隨后被高爾基體修飾去掉信號(hào)肽，形成前體，并被運(yùn)送到液泡，經(jīng)修飾性蛋白酶水解裂解為成熟的酸性亞基（α）和堿性亞基（β），并儲(chǔ)藏于PB Ⅱ中[5]，在人體中經(jīng)過蛋白酶分解后被吸收利用。醇溶蛋白貯存在致密的一型蛋白體（protein body Ⅰ， PB Ⅰ）中，不能被人體消化利用[4，6]。

日本學(xué)者通過化學(xué)誘變手段獲得一個(gè)種子胚乳谷蛋白含量明顯降低的突變體 NM67，再利用原始親本進(jìn)行輪回選擇，培育出第一個(gè)低谷蛋白水稻 LGC-1[7]。與普通水稻相比，LGC-1中可吸收的谷蛋白明顯減少，谷蛋白含量低于4%。萬建民等[8]以 LGC-1為母本，與日本優(yōu)質(zhì)粳稻越光雜交配組，并以越光為輪回親本連續(xù)回交并結(jié)合分子標(biāo)記選擇，培育出了國(guó)內(nèi)第一個(gè)低谷蛋白水稻新品種 W3660。張?jiān)戚x等[9]將LGC-1與江蘇大面積推廣的優(yōu)良品種武育粳3號(hào)雜交，經(jīng)過6代分子標(biāo)記輔助選擇及SDS-PAGE驗(yàn)證，選育出3個(gè)綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的低谷蛋白粳稻新品系。陳達(dá)剛等[10]利用W3660與優(yōu)良秈稻品種五山絲苗雜交、回交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將LGC-1基因?qū)攵i稻品種中，選育出一個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的秈型低谷蛋白水稻新品系。

本實(shí)驗(yàn)室于2013年從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源庫(kù)引進(jìn)張?jiān)戚x等[9]創(chuàng)制的3個(gè)低谷蛋白粳稻新品系2054、2059 和 2084，分別命名為HNG1、HNG2和HNG3，在山東試驗(yàn)種植，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)量偏小，莖稈變細(xì)易倒伏，穗子變小，且著粒密度降低，穗粒數(shù)變少，不適宜山東及黃淮稻區(qū)北部種植。隨著低谷蛋白大米需求量的增加，生產(chǎn)中急需適宜黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白水稻新品種。本研究利用其中的1個(gè)低谷蛋白粳稻新品系2054（田間編號(hào)HNG1），與本課題組選育的優(yōu)良食味水稻圣稻735配置雜交組合，利用圣稻735連續(xù)進(jìn)行4次回交，并進(jìn)行了3次自交，且從BC1F1代開始，每個(gè)世代的每個(gè)單株均進(jìn)行LGC-1基因型檢測(cè)，于2017年選育出1個(gè)適宜黃淮稻區(qū)種植的綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的低谷蛋白中熟中粳水稻新品種17F2J3，其谷蛋白含量、株高與 LGC-1 相當(dāng)，生育期、穗部結(jié)構(gòu)、單株理論產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀顯著優(yōu)于HNG1，這為黃淮稻區(qū)低谷蛋白水稻生產(chǎn)提供了優(yōu)良的品種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為引進(jìn)的低谷蛋白新品系HNG1和受體親本圣稻735。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 從BC1F1世代開始，每個(gè)世代的材料均按單株在分蘗盛期掛牌取葉片，并凍存于-20℃冰箱。采用稍加修改的CTAB法提取植物總DNA，將葉片盛入2.0 mL 離心管中，65℃烘干，放入鋼珠，打樣器研磨至粉末狀；隨后加入600 μL 65℃預(yù)熱的2×CTAB提取液（含2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA），65℃ 溫浴30 min，期間振蕩兩次；加入600 μL氯仿混勻，12 000 r/min離心10 min，取出后吸取300 μL上清液到一個(gè)新的1.5 mL離心管中；加入300 μL異丙醇輕輕顛倒混勻，室溫靜置30 min；12 000 r/min離心10 min以沉淀DNA，倒掉上清液；加入600 μL 75%乙醇洗滌沉淀，倒掉上清液，放入通風(fēng)櫥內(nèi)吹干DNA；加入200 μL TE（10 mmol/L Tris-base， 0.1 mmol/L EDTA）溶解DNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè) 分子標(biāo)記的選用參照Chen等[11]的方法，2 對(duì)引物分別為 InDel-Lgc1-1：正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′，反向引物序列 5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′； InDel-Lgc1-2：正向引物序列 5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′，反向引物序列 5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′。PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括：2×PCR Buffer for KOD FX 10 μL，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，KOD FX酶0.2 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min；10℃保溫。反應(yīng)產(chǎn)物在GelRed預(yù)染的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像儀上觀察記錄。

1.2.3 種子總蛋白提取和SDS-PAGE分析 新創(chuàng)制的品系和親本材料，每株各取20粒成熟種子，蛋白提取參照Cagampang等[12]。將種子在研缽中碾碎后，稱取20 mg轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，加入700 μL蛋白提取液（8 mol/L 尿素，4% SDS，5% β-巰基乙醇，20%甘油，50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，少量溴酚藍(lán)指示劑），渦旋混勻，放入50℃烘箱6～8 h，期間顛倒樣品數(shù)次以提取充分，12 000 r/min離心 5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用，用于SDS-PAGE分析。采用Bio-Rad梯度灌膠系統(tǒng)制備8%～18%梯度分離膠，濃縮膠濃度為6%。取5 μL上清液點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，80 V電泳1 h，過濃縮膠界面后120 V電泳2 h。電泳完畢后凝膠在染色液（0.1% 考馬斯亮藍(lán)R250，25%異丙醇，10%乙酸）中染色2 h后，在10%乙酸中脫色至背景透明，蛋白條帶清晰。蛋白凝膠采用Bio-Rad凝膠成像儀（Molecular Image ChemiDOCTM XRS+ Imaging system）Image Lab 5.2軟件拍照，選取“蛋白膠的考馬斯亮藍(lán)染色模式”，拍照完成后該軟件分析各泳道條帶，并對(duì)各條帶蛋白量進(jìn)行定量，計(jì)算谷蛋白占總蛋白的比例，重復(fù)取平均值。根據(jù)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)得的總蛋白質(zhì)含量，計(jì)算得到送檢樣品的谷蛋白含量絕對(duì)值。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查 水稻成熟期新品種和親本各隨機(jī)選 10 個(gè)單株，分別考察株高、單株有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬和千粒重，取平均值作為材料的性狀值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低谷蛋白水稻新品系的選育過程

2013年從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)了HNG1種質(zhì)資源，并用優(yōu)良食味水稻新品種圣稻735為母本、HNG1為父本配置雜交組合。同年冬天海南種植F1，并用圣稻735進(jìn)行回交，獲得BC1F1種子。2014年濟(jì)南正季種植23株BC1F1，挑選生育期適中、農(nóng)藝性狀好的單株利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶有低谷蛋白基因型的單株共5株，分別用圣稻735與其回交，得到BC2F1種子。同年冬天在海南分別種植BC2F1群體，每個(gè)群體20株，挑選抗稻瘟病、農(nóng)藝性狀好的單株進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶有低谷蛋白基因型的單株共4株，分別用圣稻735與其回交，得到BC3F1種子。2015年濟(jì)南正季種植4個(gè)BC3F1群體，每個(gè)群體20個(gè)單株，挑選生育期適中、農(nóng)藝性狀好、豐產(chǎn)性好的單株進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶有低谷蛋白基因型的單株共6株，分別與圣稻735進(jìn)行回交，獲得BC4F1種子。同年冬天海南分別種植BC4F1群體，每個(gè)群體20株，挑選抗稻瘟病、農(nóng)藝性狀好的單株進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶有低谷蛋白基因型的單株24株，按單株收獲種子。2016年濟(jì)南正季分別種植BC4F2群體，每個(gè)群體種植500株，在每個(gè)群體中挑選生育期適中、抗病性好、農(nóng)藝性狀優(yōu)、豐產(chǎn)性好的單株進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，得到目標(biāo)單株10個(gè)。同年海南種植10個(gè)BC4F3家系，每個(gè)家系30株，挑選出稻瘟病抗性好、農(nóng)藝性狀較好、低谷蛋白基因型純合的家系4個(gè)，按單株收獲種子，每個(gè)家系20個(gè)單株。2017年正季濟(jì)南種植BC4F4家系80個(gè)，每個(gè)家系50株，根據(jù)生育期、抗病性、一致性及農(nóng)藝性狀等因素進(jìn)行選擇，挑選其中的3號(hào)家系（田間編號(hào)17F2J3）進(jìn)行基因型驗(yàn)證、種子全蛋白SDS-PAGE分析。最終選育出一個(gè)低谷蛋白、農(nóng)藝性狀優(yōu)異且適宜黃淮稻區(qū)種植的水稻新品種（圖1）。

2.2 低谷蛋白基因的PCR檢測(cè)

在新品種選育過程中，從BC1F1代開始，每個(gè)世代均用 InDel-Lgc1-1 和 InDel-Lgc1-2 兩對(duì)標(biāo)記對(duì)各單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有材料均可擴(kuò)增出一條509 bp條帶，只有攜帶LGC-1基因的單株可擴(kuò)增出一條881 bp條帶。如圖2所示，在23個(gè)BC1F1單株中，共檢測(cè)到8個(gè)帶有低谷蛋白基因型的單株（單株11條帶較弱，未統(tǒng)計(jì)），根據(jù)生育期、農(nóng)藝性狀選擇其中的5株進(jìn)行回交，構(gòu)建BC2F1群體。后續(xù)試驗(yàn)與之相似。對(duì)2017年中選家系17F2J3中的6個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，家系中6個(gè)單株和HNG1均擴(kuò)增出低谷蛋白基因型帶型，而圣稻735表現(xiàn)正常谷蛋白基因型帶型 （圖3） 。利用新開發(fā)的高分辨熔解曲線技術(shù)（high-resolution melting curve，HRM）檢測(cè)圣稻735、HNG1和17F2J3家系中的6個(gè)單株，檢測(cè)結(jié)果與PCR擴(kuò)增的一致（圖4）。

2.3 種子總蛋白SDS-PAGE分析

種子總蛋白的 SDS-PAGE 分析表明，17F2J3家系中6個(gè)單株及HNG1 成熟谷蛋白的酸性亞基（ 37～39 kD）和堿性亞基（ 22～23 kD） 含量明顯低于圣稻735（圖5） 。經(jīng)軟件分析，圣稻735、HNG1和17F2J3中谷蛋白占總蛋白的比例分別為71.99%、31.76%和32.27%（表1）。經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)得圣稻735、HNG1和17F2J3的總蛋白質(zhì)含量分別為7.9%、7.2%和7.5%。因此，推算出圣稻735、HNG1和17F2J3的谷蛋白含量分別為5.69%紅色峰圖為圣稻735，綠色峰圖為HNG1及17F2J3家系中的6個(gè)單株。

2.4 低谷蛋白新品系農(nóng)藝性狀調(diào)查

17F2J3是從BC4F4家系中選出的一個(gè)低谷蛋白基因型純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)異的家系（如圖6）。該材料的株型、劍葉形態(tài)與圣稻735相近，株高稍低（與HNG1相近），千粒重稍小，抽穗期比圣稻735提前4～5 d，生育期150 d左右；分蘗、穗長(zhǎng)、一次枝梗、二次枝梗、穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬等農(nóng)藝性狀與圣稻735無顯著差異，見表2。

3 討論與結(jié)論

谷蛋白是水稻種子中的主要貯藏蛋白，也是能被人體消化吸收的主要蛋白。隨著生活水平的提高，腎臟病患者人數(shù)逐年上升，據(jù)中國(guó)腎臟病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)慢性腎臟病患者約有 1.2×108，發(fā)病率已達(dá) 10.8%。由于慢性腎臟病患者在蛋白質(zhì)代謝方面存在障礙，需要對(duì)蛋白質(zhì)的攝入進(jìn)行嚴(yán)格控制，普通大米中富含的谷蛋白會(huì)加重其腎臟負(fù)擔(dān)，加速腎臟功能的衰退。因此，培育低谷蛋白水稻新品種，替代普通大米作為主食，降低大米中植物蛋白攝入量，可減少血液中的氮素滯留，減輕腎臟的負(fù)擔(dān)，從而延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)程，提高生存質(zhì)量。

日本學(xué)者最早選育出一個(gè)低谷蛋白水稻品種LGC-1，其谷蛋白含量低于4%，腎臟病患者長(zhǎng)期食用LGC-1大米，其病情得到顯著改善[7]。圣稻735是山東省水稻研究所培育的優(yōu)良食味水稻新品系，具有早生快發(fā)、耐密植、肥水利用率高等特點(diǎn)，適宜在魯南、魯西南作麥茬稻種植，在魯北作一季春稻種植。本研究引進(jìn)了江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用LGC-1創(chuàng)制的低谷蛋白新品系2054，將其與圣稻735雜交，經(jīng)過4次回交和3次自交以及生育期、抗病性、農(nóng)藝性狀篩選，并結(jié)合分子標(biāo)記選擇，于2017年選育出1個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良、抗病性強(qiáng)的低谷蛋白水稻新品種17F2J3。經(jīng)基因型檢測(cè)、蛋白SDS-PAGE分析、總蛋白測(cè)定，其谷蛋白含量顯著低于背景親本圣稻735，與HNG1相當(dāng)。本研究在實(shí)施過程中緊盯材料低谷蛋白特性，同時(shí)根據(jù)農(nóng)藝性狀、抗性指標(biāo)進(jìn)行綜合選擇，選育出的新品種穗長(zhǎng)、單株有效穗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重等性狀與圣稻735無顯著差異；株高降低，其抗倒伏能力較圣稻735增強(qiáng)。新品種17F2J3為適合黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白高產(chǎn)水稻新品種。

本研究后期利用了新開發(fā)的HRM技術(shù)檢測(cè)單株基因型，該技術(shù)具有操作便捷、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合分離材料大規(guī)模篩選。利用該方法，可將 “先種后檢”試驗(yàn)?zāi)Ｊ睫D(zhuǎn)變?yōu)椤跋葯z后種”模式，在早期世代（如回交1次）利用大的分離群體進(jìn)行基因選擇，篩選出帶有目標(biāo)基因的單株種植成群體，從中挑選抗性好、熟期適中、產(chǎn)量潛力突出的單株，然后按株系種植，通過擴(kuò)大群體，加大得到優(yōu)良單株的概率，從而縮短育種周期，加快新品種培育進(jìn)程。這為今后水稻分子育種提供了新的思路。

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