HPLC-ELSD測定銀杏葉刺梨膠囊中銀杏萜類內酯的含量

周亞杰，馮鵬，郭原，馮敏

（南京中科藥業(yè)有限公司，江蘇南京210008）

保健食品銀杏葉刺梨膠囊的配方組成為銀杏葉提取物、刺梨汁粉、微晶纖維、糊精和硬脂酸鎂等。前期的研究表明該配方能改善免疫性肝損傷大鼠肝功能和改善四氯化碳引起的小鼠肝損傷，并且在兩種藥理模型中復方作用均優(yōu)于單一銀杏葉提取物[1-2]。銀杏葉提取物含有黃酮類、萜類內酯、有機酸等多種成分。具有抗氧化、改善循環(huán)、抗血小板聚集、保護神經系統(tǒng)等主要藥理作用[3]。臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病，并具有較顯著的效果[4]，廣泛用于藥品、保健食品中，其中以銀杏葉提取物為主要功能成分的保健食品有200多個。銀杏萜類內酯是銀杏葉提取物的重要活性成分之一，其中，白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C是常用的檢測指標，用來控制銀杏葉提取物和銀杏葉制劑的品質[5]。銀杏內酯為血小板活化因子拮抗劑，可用于治療腦血栓、心機梗塞等心腦血管疾病[6]。銀杏葉萜類內酯的分析檢測方法包括高效液相色譜-示差折光檢測器法（high performance liquid chromatography-refractive index，HPLC-RI）[7]、毛細管氣相色譜法[8]和超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry，UPLC-MS-MS）[9]等。也有研究者建立了“一測多評”的方法，以白果內酯為內參物，計算銀杏內酯A、B、C的校正因子，測得4個萜類內酯的含量[10]。本試驗采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）同時測定銀杏葉刺梨膠囊中銀杏萜類內酯的含量，為該產品的質量控制提供數(shù)據(jù)。含銀杏葉提取物的保健食品多以銀杏黃酮或者總黃酮為指標控制產品的質量，較少以銀杏萜類內酯的含量為指標控制產品質量[11]。試驗建立的方法可用于以銀杏葉提取物為功能成分的保健食品的質量分析。

1 材料與設備

1.1 試劑與材料

鹽酸、醋酸鈉、乙酸乙酯（分析純）：南京市化學試劑公司；甲醇（色譜純）：山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；純凈水：市售包裝飲用純凈水；白果內酯（批號110865-201306）、銀杏內酯 A（批號 110862-201310）、銀杏內酯B（批號110863-201410）、銀杏內酯C（批號110864-201307）：中國食品藥品檢定研究院；復方銀杏刺梨膠囊（批號分別為 170101，170102，170103）：南京中科藥業(yè)有限公司自制。

1.2 儀器

Waters E2695自動進樣高效液相色譜儀（配有Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器）：Waters公司；AG285型電子天平（萬分級）、MS105DU型電子天平（十萬分級）：梅特勒-托利多有限公司；KQ-250DB型數(shù)顯超聲波清洗器：昆山市超聲儀器公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水 =30 ∶70（體積比），柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min；ELSD檢測器霧化溫度100℃，霧化氣為空氣，氣流速度2.5 L/min[12-13]。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取白果內酯（bilobalide，BB）5.47 mg、銀杏內酯A（ginkgolide A，GA）5.22 mg、銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）5.40 mg、銀杏內酯 C（ginkgolide C，GC）5.46mg，置于5mL容量瓶中，加甲醇使超聲溶解并稀釋至刻度，混勻，得標準儲備液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

參照《中國藥典》銀杏葉提取物中的方法進行供試品溶液的制備，具體如下：取銀杏葉刺梨膠囊內容物，研細，精密稱定1.0 g內容物粉末，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 33 kHz）20 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，揮干甲醇，殘渣加水10 mL，置水浴中溫熱使溶散，加2%鹽酸溶液2滴，用乙酸乙酯振搖提取4次（分別15、10、10、10 mL），合并提取液，用 5%醋酸鈉溶液 20 mL洗滌，分取醋酸鈉溶液，再用乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯提取液及洗滌液，用純凈水洗滌2次，每次20 mL，分取純凈水，用乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[14]。

2.4 線性關系的考察

取對照品標準儲備液，注入液相色譜儀，進樣體積分別為 4、6、8、10、12 μL，分別以 BB、GA、GB、GC 峰面積的自然對數(shù)為縱坐標（Y），各對照品進樣濃度的自然對數(shù)為橫坐標（X）做標準曲線。

2.5 專屬性試驗

按比例制備不含銀杏葉提取物的陰性樣品，精密稱取陰性樣品粉末2.0 g，按照2.3方法制備陰性對照樣本供試品液。

2.6 精密度試驗

取2.2中的標準儲備液，按2.1色譜條件連續(xù)進樣6次。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取銀杏葉刺梨膠囊（批號：170101）內容物，按照2.3方法制備供試品溶液，分別在溶液制備后0、2、4、6、8、10 h 進樣，進樣體積為 10 μL，測定峰面積。

取對照品標準儲備液，注入液相色譜儀，進樣體積為 10 μL。分別在 0、2、4、6、8、10 h 進樣，測定峰面積。

2.8 重復性試驗

取銀杏葉刺梨膠囊（批號：170101）內容物，按照2.3方法制備供試品溶液6份，按照2.1的色譜條件測定總萜內酯的含量。

2.9 加標回收率試驗

精密稱取銀杏葉刺梨膠囊（批號：170101）內容物0.5 g，共6份，再加對照品適量，按照2.3方法制備供試品溶液，按照2.1色譜條件測定含量，計算回收率。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

得回歸方程分別為YBB=1.534 9X+7.106 6，R2=0.999 6；YGA=1.765 6X+6.881 1，R2=0.999 2；YGB=1.637 0X+6.827 0，R2=0.999 0；YGC=1.590 0X+6.961 1，R2=0.999 3。結果如圖1。

3.2 專屬性試驗結果

陰性樣品色譜圖中在萜類內酯相應保留時間上沒有干擾峰，說明在本條件下其他成分對萜類內酯含量測定無干擾結果見圖2。

圖1 白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C的線性回歸曲線Fig.1 Linear regression curve of BB，GA，GB，and GC

圖2 陰性樣本、混合對照品和樣品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of blank sample，mixed references and samples

3.3 測試方法的精密性

測定BB、GA、GB、GC峰面積的RSD分別為2.50%、1.83%、2.26%和1.78%，均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

3.4 測試方法的穩(wěn)定性

銀杏葉刺梨膠囊（批號：170101）供試品測定結果為BB、GA、GB、GC峰面積的RSD分別為2.72%、1.75%、2.28%、1.99%，均小于3.00%，表明供試品溶液在室溫（18℃～26℃）條件下放置10 h穩(wěn)定。

對照品標準儲備液測定結果為BB、GA、GB、GC峰面積的RSD分別為2.22%、1.95%、2.08%、1.79%，均小于3.00%，表明對照品溶液在室溫（18℃～26℃）條件下放置10 h穩(wěn)定。

3.5 重復性試驗結果

測定6份樣本中總萜內酯的含量分別為1.661 1、1.630 1、1.708 9、1.736 6、1.740 7、1.641 1 g/100 g，平均值為1.686 4 g/100 g，RSD為2.89%，小于3.00%，表明該方法重復性好。

3.6 加標回收率

加樣回收率數(shù)據(jù)見表1，平均回收率在95%～105%之間，RSD均小于3.00%。表明試樣方法滿足加標回收。

3.7 樣品的測定

取3批銀杏葉刺梨膠囊（批號分別為170101、170102、170103），每批樣本同時測試兩份，按照2.3方法制備供試品溶液，依法進樣測定。每份樣本進樣兩次，取平均值。銀杏葉萜類內酯含量=（白果內酯含量+銀杏內酯A含量+銀杏內酯B含量+銀杏內酯含量），結果見表2。

表1 銀杏葉刺梨膠囊萜類內酯加樣回收率試驗Table 1 Recovery data of ginkgolides in ginkgo leaf and Rosa roxburghii capsule

表2 HPLC法測定銀杏總萜內酯含量Table 2 The content of ginkgolides

4 結論

銀杏葉提取物在銀杏葉刺梨膠囊中占比為26%，根據(jù)《中國藥典》對銀杏葉提取物的質量要求[12]，其中萜類內酯含量需要≥6.0%，理論上銀杏葉刺梨膠囊中銀杏葉萜類內酯含量需≥1.56%。本試驗測定結果表明3批次樣品的銀杏葉萜類內酯含量分別為1.97%、2.35%、2.07%，平均值為2.13%，均大于理論值?？紤]到大生產時，各批次間的差異，依據(jù)含量限定值為實測值75%～80%的原則，可將銀杏葉刺梨膠囊中總萜內酯含量限定值定為≥1.70 g/100 g。本試驗建立的方法萜類內酯附近無雜峰的干擾，能準確測定銀杏葉刺梨膠囊中萜類內酯的含量。本試驗建立的方法可用于含有銀杏葉提取物的保健食品和功能食品中銀杏葉萜類內酯的質量分析。