固相萃取-高效液相色譜法同時測定蔬菜制品中11種合成著色劑

劉劍波，余蓮芳，朱明揚，高煒

（岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，湖南岳陽414000）

著色劑即使食品賦予色澤和改善食品色澤的物質(zhì)。食用著色劑分為人工合成著色劑和天然著色劑兩大類。人工合成著色劑由于著色力好，色彩鮮艷，色調(diào)多樣，成本低廉等原因在食品中被廣泛使用[1-2]。中國允許在食品中添加的人工合成著色劑依據(jù)GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》有：檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、喹啉黃、赤蘚紅共11種[3]。人工合成著色劑種類繁多，人體攝入超過一定量，可引起慢性中毒，致突變性、致畸性、致癌性等風(fēng)險增加。蔬菜制品是指以蔬菜和食用菌為原料，采用腌制、干燥、油炸等工藝加工而成的各種產(chǎn)品，包括醬腌菜、蔬菜干制品、食用菌制品、其他蔬菜制品。蔬菜制品是我國傳統(tǒng)的加工方法，在中國居民的膳食結(jié)構(gòu)中，蔬菜制品是深受喜愛的一種佳品。蔬菜在加工過程中容易退色或變色，因此常常在加工過程中添加食用著色劑以改善其感官色澤[4-7]。GB2760-2014中規(guī)定：人工合成著色劑檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、亮藍在腌漬蔬菜中允許使用，其限量分別為：0.1、0.05、0.01、0.05、0.025 g/kg。而新紅、日落黃、酸性紅、喹啉黃、誘惑紅、赤蘚紅不得在蔬菜制品中使用[3]。目前GB 5009.35-2016《食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定》中利用聚酰胺吸附法和液-液分配法（適用于含赤蘚紅的樣品）對檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍、赤蘚紅這8種人工合成著色劑進行了檢測[8]。GB 5009.141-2016《食品安全國家標準食品中誘惑紅的測定》規(guī)定了食品中誘惑紅的測定方法[9]。SN/T 1743-2006《食品中誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測》規(guī)定了食品中誘惑紅，酸性紅，亮藍，日落黃的檢測方法[10]。DBS 32/012-2016《食品安全地方標準食品中喹啉黃的檢測》中規(guī)定了食品中喹啉黃的檢測方法[11]。要同時檢測這11種色素，需要采用4種標準方法。因此建立一種蔬菜制品中11種人工合成著色劑的高通量檢測方法對于實際應(yīng)用是非常必要的。本文旨在建立一種利用固相萃取-高效液相色譜法同時測定蔬菜制品中這11種著色劑的方法，簡化前處理步驟，優(yōu)化色譜條件，一次檢測，提高日常監(jiān)督檢測的針對性和效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測樣品為2017年岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心從本市內(nèi)抽取的蔬菜制品如香辣榨菜、剁椒風(fēng)味包、老壇酸菜包、酸豆角、麻辣海帶、油炒蘿卜、藕片、萵筍片、香辣金針菇、酸筍風(fēng)味包、鹽漬生姜、芋頭條、冬瓜片、南瓜脆片、秋葵脆片、黃瓜片、紅薯干、土豆條、原味香菇、脫水胡蘿卜。

甲醇、乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；乙酸銨（≥98%）：J&K科技；25%氨水、乙醇、檸檬酸、甲酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用水均為超純水。

檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、赤蘚紅、亮藍標準溶液：中國計量科學(xué)研究院；新紅標準溶液：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；靛藍（90.0%）、喹啉黃（97.2%）：Dr.Ehrenstorfer公司；酸性紅（90.7%）：曼哈格公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000超高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、Smart 2pure超純水機：美國賽默飛公司；H1850R高速冷凍離心機：湖南湘儀儀器有限公司；BAS224S電子分析天平：德國賽多利斯股份公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-600E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；渦旋儀QL-866：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Sepline-S4全自動固相萃取儀：萊伯泰科；Oasis WAX固相萃取小柱（150 mg/6 cc）：美國 Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取樣品1 g至2 g于10 mL離心管中，加入5 mL25%的氨水乙醇，渦旋混勻后超聲提取10 min，高速冷凍離心10 min（4℃，10 000 r/min）后立即將上清液轉(zhuǎn)入雞心瓶中，殘渣重復(fù)提取2次，合并3次上清液。40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL左右，用水轉(zhuǎn)移入玻璃管中，用200 g/L檸檬酸調(diào)pH值至5.0左右，待Oasis WAX小柱凈化。將凈化柱裝入全自動固相萃取儀，把進樣管和收集管放入指定位置，編輯相應(yīng)的方法管理程序，填充試劑通道并清洗進樣針之后，依次按照方法用6 mL甲醇和6 mL純水潤洗小柱，上樣時過柱的速度設(shè)置為1.0 mL/min，不收集濾液。再用甲醇∶甲酸∶水=2∶1∶7（體積比）的溶液10 mL淋洗小柱，干燥時間設(shè)置為10 s。最后用15 mL10%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，干燥時間設(shè)置為15 s。取出洗脫液于50℃氮吹至近干后，用2 mL 20%甲醇水溶液溶解殘渣，過0.45 μm聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）濾膜，待測。

1.3.2 標準溶液的制備

配制 0.2 μg/mL～40 μg/mL 濃度范圍的檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、喹啉黃、赤蘚紅的混合標準溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。喹啉黃主要由4個峰組成（分別為QYNa2Ⅰ、QYNa2Ⅱ、QYNaⅠ、QYNaⅡ），本方法把4個峰設(shè)為一組，由軟件進行組校準。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）250 mm×4.6 mm；柱溫30℃；流動相A：甲醇 ∶乙腈（4∶1），流動相B：0.02 mol/L乙酸銨；流速1 mL/min；液相色譜流動相梯度洗脫程序見表1，多通道檢測，檸檬黃、喹啉黃415 nm，新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅515 nm，靛藍、亮藍610 nm。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取

本文研究的蔬菜制品對象主要分為腌制蔬菜、脫水蔬菜和膨化蔬菜三大類。通過參考文獻以及國標方法主要考察甲醇-水溶液、乙醇-氨水-水溶液以及氨水-乙醇溶液對樣品中色素的提取效果，甲醇-水溶液的提取液渾濁，不利于轉(zhuǎn)移上清液以及過柱，而膨化蔬菜具有一定的油脂，脫水蔬菜吸水性較強，所以不宜采用水比例較大的提取液。其中氨水-乙醇作為提取溶劑，樣品中的色素提取較為完全。通過試驗發(fā)現(xiàn)隨著氨水-乙醇溶液中氨水濃度的提高，合成色素的溶出更加充分，但提取液卻越渾濁，最后確定用25%的氨水-乙醇作為提取溶劑。超聲后進行高速冷凍離心，然后立即轉(zhuǎn)移上清液能更好地分離油脂和水層[12-16]。

2.1.2 樣品凈化

本文研究的11種有機合成著色劑都含有磺酸基團，因此選擇弱陰離子固相萃取小柱Waters Oasis WAX（150 mg/6 cc）對樣品進行凈化處理。提取液濃縮轉(zhuǎn)移后使用檸檬酸調(diào)pH值至5.0左右，可以使合成色素的磺酸基成電離狀態(tài)，有利于提高色素在凈化柱上的保留性和選擇性。試驗中使用含有一定甲酸的甲醇水溶液作為淋洗液既能有效地洗掉天然色素等雜質(zhì)又能取得較滿意的回收率。通過試驗比較了氨水乙醇、氨水甲醇以及甲醇作為洗脫液時在凈化柱上的回收率，氨化甲醇的使用結(jié)果較為滿意。氨化甲醇溶液氨水所占的比例越高，洗脫能力越強，但不利于氮吹濃縮，最終確定氨化甲醇的濃度為10%。國標方法中含赤蘚紅的樣品需要用液-液分配法單獨處理，本文由于赤蘚紅在Oasis WAX柱上的保留性較強，所以加大洗脫液用量至15 mL。樣品在最后定容時使用20%甲醇水溶液溶解殘渣，有效地保證了赤蘚紅的回收率。過濾樣品溶液時應(yīng)選擇吸附作用小的聚四氟乙烯（PTFE）濾膜[12-16]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相

檢測時使用的流動相既要能夠使目標物得到有效的分離，又要能改善峰形，提高靈敏度。本文選用甲醇∶乙腈（4∶1）作為流動相A，0.02 mol/L乙酸銨作為流動相B。乙腈的加入能顯著地改善峰的不對稱性，提高靈敏度。而在流動相中作為調(diào)節(jié)劑的無機電解質(zhì)的加入對于改善可電離物質(zhì)的分離以及獲得一個合理且較短的分析時間是很有必要的。乙酸銨緩沖溶液的濃度定為0.02 mol/L，乙酸銨的濃度越大，由于鹽析效應(yīng)增強導(dǎo)致分析物與色譜柱固定相的作用增強，因此分析物的保留時間增加[16]。乙酸銨緩沖溶液的濃度為0.02 mol/L時，溶液pH值約為6.5，所有著色劑都以中性化合物存在，以便發(fā)生反相機制，因此緩沖溶液的pH值無需優(yōu)化。

2.2.2 梯度洗脫程序

本文使用4 μg/mL的11種合成著色劑的混合標準溶液來試驗最佳的分離條件。最初9 min內(nèi)有機相比例緩慢上升，使檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍達到有效分離。9 min至12 min，加快了有機相上升的速率，分離胭脂紅、日落黃、喹啉黃，然后高有機相比例保持幾分鐘使誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍依次洗脫下來，最后2 min回到初始流動相比例來平衡色譜柱。優(yōu)化的梯度程序見表1。

2.2.3 檢測波長

本試驗采用二極管陣列檢測器在190 nm～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，找到各個組分的特征吸收波長。結(jié)合梯度洗脫的分離效果以及各個組分的特征吸收，確定采用多通道檢測這11種色素。在415 nm下檢測檸檬黃、喹啉黃，在515 nm下檢測新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅，在610 nm下檢測靛藍和亮藍。在以上檢測波長條件下，各色素的同時檢測互不干擾，能夠?qū)崿F(xiàn)準確地定性與定量。分離效果見圖1。

圖1 4 μg/mL的11種合成著色劑的混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solutions of 11 synthetic colorants at 4 μg/mL

2.3 線性范圍與檢出限

在 0.2 μg/mL～40 μg/mL 范圍內(nèi)，以混合標準溶液的質(zhì)量濃度X為橫坐標，其相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線。11種合成色素的質(zhì)量濃度與其峰面積呈良好線性關(guān)系，檢出限以3倍信噪比計算。各色素的檢測波長、保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

2.4 回收率與精密度

以未檢出色素的酸菜包作為空白基質(zhì)，制作1、2、10 mg/kg 3個水平的加標樣品，上述每個添加水平做6次平行測定，回收率及相對標準偏差見表3。

由表3可知，在1、2、10 mg/kg 3個添加水平時，11種色素的加標回收率在87.5%～102.6%，相對標準偏差在1.5%～5.8%，由此可見該方法有較高的準確性和可靠性。

表2 11種合成色素的檢測波長、保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Detection wavelength，retention time，linear equation，correlation coefficient and detection limit of 11 synthetic colorants

表3 空白酸菜包樣品中11種色素加標回收率及相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 11 synthetic colours in blank samples

圖2 檢出人工合成色素的樣品色譜圖Fig.2 Sample chromatograms for detection of synthetic colorants

2.5 實際樣品分析

采用該方法對岳陽市食品生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的蔬菜制品進行了50批次的檢測，檢測結(jié)果顯示在腌漬蔬菜制品中添加檸檬黃的現(xiàn)象比較普遍，其含量均未超出GB 2760-2014中0.1 g/kg的限量規(guī)定。對于腌漬水和蔬菜一起包裝的蔬菜制品，應(yīng)取可食用的腌漬蔬菜部分進行檢測。此外，在少數(shù)膨化蔬菜制品中有一定的亮藍檢出。檢出合成色素的酸豆角和黃瓜片樣品的色譜圖見圖2。酸豆角中檸檬黃的檢出結(jié)果為0.024 g/kg，黃瓜片中亮藍的檢出結(jié)果為0.009 g/kg。

3 結(jié)論

本方法采用弱陰離子固相萃取小柱進行前處理，梯度洗脫，多波長同時測定蔬菜制品中11種人工合成著色劑，改變了傳統(tǒng)方法一次只能檢測少數(shù)色素的狀況，且具有操作簡便，準確度高、精密度好的優(yōu)點。樣品提取后，采用全自動固相萃取儀進行凈化，大大提高了檢測效率，節(jié)約了人力成本。本方法在實際樣品檢測應(yīng)用中結(jié)果良好，能滿足日常蔬菜制品的監(jiān)管檢測需求，具有實際應(yīng)用價值。