亞麻多肽制備及其抗氧化活性分析

吳峰，王常青，石亞偉，*

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

亞麻（linum usitatissimum linn）也稱胡麻，是我國五大油料作物之一，我國油用亞麻（胡麻）主要分布在華北、西北等地，主產(chǎn)區(qū)是內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西、陜西和新疆，西南地區(qū)的云南等地也有種植[1-4]。亞麻餅粕屬于亞麻籽榨油后的下腳料，其粗蛋白的含量高達(dá)43%左右，亞麻籽粕含有豐富的α-亞麻酸、木質(zhì)素以及蛋白類等物質(zhì)[5]，同時也含有豐富的維生素A、維生素B、維生素E等維生素，具有很高的營養(yǎng)價值，可作為油料作物配合開發(fā)新營養(yǎng)主食品種的原料，但是亞麻餅粕通常作為動物飼料或肥料使用，存在著巨大的浪費(fèi)。

植物蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶部分水解后，可獲得具有生物活性的多肽諸如抗氧化作用、降血脂、抗腫瘤、抗高血壓、活化細(xì)胞免疫機(jī)能等多肽[6-9]，是現(xiàn)代食品和醫(yī)藥領(lǐng)域最熱門的研究方向，也是提升植物蛋白利用價值的主要方向。目前對于大豆、花生等原料多肽的制備工藝和功能性進(jìn)行較多的研究，如周婷婷等[10]篩選制備抗氧化大豆多肽的水解酶及水解條件，從而得到高效的抗氧化大豆多肽制品；劉英麗等[11]研究確定了酶解花生粕制備抗氧化肽的最佳工藝參數(shù)。目前國內(nèi)對于亞麻的研究主要集中在亞麻油脂的開發(fā)利用，而對亞麻蛋白質(zhì)的研究關(guān)注較少，特別是對脫脂亞麻粉中蛋白肽的制備研究甚少。亞麻籽蛋白也是一種優(yōu)良的植物蛋白[12]，（以亞麻餅粕為原料，通過對不同蛋白酶的酶解效率比較，建立3.350酸性蛋白酶解亞麻籽粕制備多肽的實驗室工藝，并對制備的亞麻多肽的還原能力和清除O2-·和DPPH·的能力，進(jìn)行測定，顯示其具有較好的體外抗氧化活性，為后續(xù)亞麻多肽飲料和功能性食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胃蛋白酶（30U/mg）、胰蛋白酶（165 U/mg）：Solarbio公司；木瓜蛋白酶（10萬U/g）、菠蘿蛋白酶（80萬U/g）、537酸性蛋白酶（2.05萬U/g）：廣西龐博生物工程有限公司；3.350黑曲酸性蛋白酶（35 000 U/g）：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；亞麻籽粕：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；苦肽（MLIPPFFVI）：華大基因合成；亞麻胰蛋白酶抑制劑（LUTI）為山西大學(xué)生物技術(shù)研究所制備。

1.2 儀器與設(shè)備

QT2000自動液相色譜分離純化層析儀：上海琪特分析儀器有限公司；Lambda 35雙光束紫外可見光光度計：珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司；D-37520高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher Scientific公司；FD8-4T冷凍干燥儀：GOLD-SIM公司。

1.3 多肽含量和多肽得率的測定

亞麻多肽含量參照QB/T2879-2007《海洋魚低聚肽粉測定》[13]中的三氯乙酸沉淀法測定，其中總氮采用半微量凱氏定氮法，氨基酸態(tài)氮按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的甲醛滴定法測定。

多肽得率/%＝（離心上清液中總氮量-離心上清液中氨基酸態(tài)氮含量）/樣品中總氮量×100

1.4 亞麻蛋白粉的制備

取一定量烘干的亞麻餅粕粉按1∶30（g/mL）加入蒸餾水，用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH值到9.5～10.0，在60℃的水浴中保溫攪拌3 h，然后離心取上清液。沉淀物進(jìn)行二次提取、離心。兩次上清液合并后，用稀鹽酸調(diào)pH值到4.0～4.5沉淀蛋白，并水洗兩次；水洗蛋白用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值到7.0，然后冷凍干燥，得到成品亞麻蛋白粉。

1.5 水解多肽蛋白酶的篩選

準(zhǔn)確稱取亞麻蛋白粉，按1∶20（g/mL）加入蒸餾水，按每克蛋白6 000 U的酶劑量分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、537酸性蛋白酶和3.350酸性蛋白酶，在各種蛋白酶的適宜條件下水解2 h，沸水浴30 min滅酶活，離心分離（8 000 r/min，10 min），取上清液，測定多肽含量。以多肽得率為指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。

1.6 亞麻多肽制備工藝條件的優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗

以亞麻多肽得率為評價指標(biāo)，用篩選出的酶解多肽得率最高的蛋白酶做進(jìn)一步的單因素試驗。按料液比 1 ∶20（g/mL），考察該酶在不同酶解溫度（30、40、50、60、70）、酶解 pH 值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）、加酶量（3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）和酶解時間（1、2、3、4、5 h）4個單因素條件下對多肽得率的影響。

1.6.2 正交試驗

以單因素試驗的試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，在酶解溫度、酶解pH值、加酶量和酶解時間,四因素三水平下做正交試驗，確定多肽得率最佳的酶解條件。正交試驗方案L9（34），見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.7 抗氧化活性研究

還原能力的測定方法參照文獻(xiàn)[14]；DPPH·清除率的測定方法參照文獻(xiàn) [15-17]；超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率的測定方法參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.8 亞麻多肽分子量分析

利用Superdex 75 prep grade凝膠色譜法測定制備的亞麻多肽的相對分子量。以已知分子量的兩種多肽，亞麻胰蛋白酶抑制劑（分子量7 612.71 Da)和化學(xué)合成的亞麻苦肽（分子量1 149.46 Da）作為參照，分別將上述標(biāo)準(zhǔn)樣及制備的亞麻水解多肽，在相同條件下,上樣Superdex 75 prep grade凝膠色譜柱，波長220 nm檢測，繪制各自洗脫體積和A220nm吸收值關(guān)系曲線，通過與兩個已知蛋白的洗脫圖譜比對，粗略測定亞麻水解多肽分子量分布范圍。

1.9 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用Minitab15軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備亞麻多肽的蛋白酶篩選

選取6種蛋白酶，在各種酶的最適條件下酶解2 h見表2。

表2 6種蛋白酶酶解亞麻蛋白溶液制備多肽效果的對比Table 2 Comparison of the effect of six proteases on enzymatic hydrolysis of defatted flaxseed meal

由表2可知，3.350酸性蛋白酶酶解亞麻蛋白得率（28.52%）最高，537酸性蛋白酶酶解亞麻蛋白得率（22.97%）次之，因此選用3.350酸性蛋白酶制備亞麻多肽。

2.2 3.350酸性蛋白酶制備亞麻多肽的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對亞麻多肽得率的影響

在酶解時間2 h，加酶量6 000 U/g，pH2.5的條件，酶解溫度對亞麻多肽得率的影響見圖1。

圖1 溫度對亞麻多肽得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of flax polypeptide

由圖1可知，當(dāng)溫度小于60℃時，多肽得率隨著溫度的升高而增大，溫度為60℃時達(dá)到最大值，溫度大于60℃時，多肽得率有所下降?？赡苁且驗槊附鉁囟容^高時，蛋白酶容易變性，從而使酶活性減弱。所以選擇60℃為下一步正交試驗的酶解溫度。

2.2.2 pH值對亞麻多肽得率的影響

pH值對亞麻多肽得率的影響見圖2。

圖2 pH值對亞麻多肽得率的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of flax polypeptides

由圖2可知，pH值對水解效果的影響顯著，3.350酸性蛋白酶酶解亞麻分離蛋白在加酶量6 000 U/g，酶解溫度60℃，酶解時間2 h時，當(dāng)pH值達(dá)到3.0時，多肽得率最大，當(dāng)pH值大于3.0時，多肽得率略有下降。3.350酸性蛋白酶在pH值較低時酶活較高，所以選取pH3.0為下一步正交試驗的酶解pH。

2.2.3 加酶量對亞麻多肽得率的影響

在酶解溫度60℃，pH值3.0，酶解時間2 h的條件下，加酶量與多肽得率的關(guān)系見圖3。

圖3 加酶量對亞麻多肽得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on yield of flax polypeptides

從圖3中可以看出，當(dāng)加酶量為6 000 U/g時，亞麻多肽得率最大，即使增加酶的量也就不會對水解速度有明顯的影響，多肽得率反而有所下降。因此，選擇蛋白酶添加量為6 000 U/g，作為下一步正交試驗的加酶量。

2.2.4 酶解時間對亞麻多肽得率的影響

當(dāng)酶解溫度60℃，pH值3.0，加酶量6 000 U/g時，酶解時間與多肽得率的關(guān)系表現(xiàn)為：當(dāng)酶解時間小于2 h時，隨著時間的延長，多肽得率快速上升，2 h時達(dá)到最大值，之后再延長酶解時間，多肽得率逐漸下降見圖4，這可能是因為隨著水解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)底物逐漸減少，且酶解產(chǎn)物不斷積累對蛋白酶本身造成抑制，或者多肽又被進(jìn)一步酶解成為氨基酸。還可能是因為隨著時間延長，多肽之間通過非共價鍵（如疏水基作用、氫鍵和配位鍵）相互聚集，產(chǎn)生了聚合反應(yīng)，導(dǎo)致多肽減少。因此，選擇酶解時間為2 h，作為下一步正交實驗的蛋白酶解時間。

圖4 酶解時間對亞麻多肽得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on yield of flax polypeptide

2.3 3.350酸性蛋白酶制備亞麻多肽的正交試驗結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，以亞麻多肽得率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，制備亞麻多肽的最佳工藝組合為A2B1C3D3，即溫度 60 ℃、pH2.7、加酶量 6 500 U/g、酶解時間2.5 h，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，制備亞麻多肽得率的提取率為38.80%。又由極差分析可知，各因素對多肽得率的影響大小順序為A＞C＞B＞D，即酶解溫度對亞麻多肽得率的影響最大，加酶量和pH值次之，酶解時間的影響最小。方差分析結(jié)果（表4）表明酶解溫度和加酶量對制備亞麻多肽得率的影響顯著，其他2個因素的影響均不顯著。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

2.4 多肽抗氧化活性分析

2.4.1 亞麻多肽相對還原力的測定

亞麻多肽的還原能力見圖5。

圖5 亞麻多肽的還原能力Fig.5 Reduction activity of flax polypeptides

由圖5可知，在0.15 mg/mL～1.2 mg/mL有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，亞麻多肽的還原能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增大，且增幅明顯。此后，隨著質(zhì)量濃度增大，亞麻多肽的還原能力變化不明顯，趨于穩(wěn)定，逐步達(dá)到其最大還原能力。

2.4.2 亞麻多肽對DPPH自由基的清除作用

亞麻多肽對DPPH自由基的清除能力見圖6。

圖6 亞麻多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of flax and polypeptide

由圖6可知，亞麻多肽DPPH自由基清除率與濃度呈正比，可能是酶解過程產(chǎn)生了能有效清除DPPH·的小分子肽類，當(dāng)酶解液質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，DPPH·清除率達(dá)到了最大值89.99%。

2.4.3 亞麻多肽對O2-·自由基的清除作用

亞麻多肽對O2-·自由基的清除能力見圖7。

圖7 亞麻多肽對O2-·自由基的清除能力Fig.7 The scavenging ability of flax and polypeptide on O2-·free radicals

由圖7可知，制備的亞麻多肽清除O2-·能力隨質(zhì)量濃度增加，有明顯的增大趨勢，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時，清除率可達(dá)85.57%；此后，隨著質(zhì)量濃度增大，亞麻多肽對O2-·清除效果變化不明顯，趨于穩(wěn)定，逐步達(dá)到其最大的清除O2-·效果。

2.5 亞麻水解多肽分子量的分布范圍

亞麻水解多肽分子量分布范圍見圖8。

圖8 亞麻水解多肽分子量分布范圍Fig.8 Molecular weight distribution of flax hydrolyzed peptides

通過Superdex 75 prep grade凝膠色譜法，對亞麻水解多肽分子量的分析，揭示亞麻水解多肽在凝膠層析的上洗脫的體積，介于亞麻胰蛋白酶抑制（7 612.71 Da）和亞麻苦肽（MLIPPFFVI，1 149.46 Da)的洗脫體積間，說明利用酸性蛋白酶3.350制備的亞麻水解多肽的分子量分布范圍主要集中在1 000 Da～7 600 Da間。

3 結(jié)論

3.350 酸性蛋白酶制備亞麻多肽單因素和正交試驗，表明制備亞麻多肽的最佳工藝條件為：酶解溫度60 ℃、pH2.7、加酶量 6 500 U/g、酶解時間 2.5 h，此條件下亞麻多肽的得率為38.80%。對亞麻多肽得率的影響因素排序為酶解溫度＞加酶量＞pH值＞酶解時間，其中酶解溫度和加酶量對亞麻多肽得率影響顯著。亞麻多肽對DPPH自由基和超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，說明亞麻多肽具有良好的抗氧化活性，并隨著多肽質(zhì)量濃度的升高，其抗氧化活性不斷增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，這為亞麻多肽功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。制備的亞麻多肽的分子量主要分布在1 000 Da～7 600 Da間的范圍，但是亞麻多肽的組成及構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。