復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化及其風(fēng)味成分分析

（廣東石油化工學(xué)院石油化工清潔生產(chǎn)工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東茂名525000）

龍眼，又稱桂圓，為無患子科龍眼屬植物。龍眼樹為常綠喬木，食用部分是假種皮，乳白或淡白色，肉質(zhì)脆，清甜[1]。其果肉含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，有補(bǔ)血安神、健腦益智、補(bǔ)養(yǎng)心脾的功效，是健脾長智的傳統(tǒng)食物，對(duì)失眠、心悸、神經(jīng)衰弱、記憶力減退、貧血及抗衰老等有益[2-3]。

我國龍眼產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)品系列化正在形成，傳統(tǒng)產(chǎn)品形式為鮮果、龍眼干及龍眼肉干[4]，深加工產(chǎn)品如龍眼果汁[5]、龍眼果酒[6]和龍眼果醋[7]等也有研究開發(fā)。龍眼果酒和龍眼果醋屬于發(fā)酵食品，近年來龍眼果酒的研究更為常見，例如，龍眼酒菌種篩選[8]、工藝優(yōu)化[9-10]及風(fēng)味分析[11]均有報(bào)道。龍眼果醋是在龍眼果酒的基礎(chǔ)上進(jìn)行醋酸發(fā)酵后制得，目前對(duì)龍眼果醋發(fā)酵工藝的研究相對(duì)較少，且缺乏對(duì)龍眼果醋風(fēng)味分析的研究[12-14]。

針對(duì)目前龍眼果醋工藝研究較少，風(fēng)味分析缺乏的現(xiàn)狀，本研究以龍眼和檸檬復(fù)合果汁為主原料，接種活性干酵母經(jīng)酒精發(fā)酵得到基酒，以基酒為基礎(chǔ)，單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝，對(duì)優(yōu)化工藝釀造所得復(fù)合龍眼果醋進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析了其風(fēng)味成分，為更符合當(dāng)代人們健康理念的龍眼果醋的成功開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與菌株

“儲(chǔ)良”品種新鮮龍眼：產(chǎn)自廣東省茂名市高州；檸檬：市售；干酵母：湖北安琪酵母有限公司；滬釀1.01醋酸菌：廣東石油化工學(xué)院食品教研室保藏。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備

普通級(jí)別白砂糖：市售；氫氧化鈉、溴鉀酚紫、鹽酸、偏重亞硫酸鉀、無水乙醇、酚酞、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；蛋白胨、葡萄糖、膽鹽、果膠酶（500 U/mg）、乳糖、瓊脂：生工生物工程（上海）股份有限公司。

HB-K800型榨汁機(jī)：廣東半球電器有限公司；DHZ-DA型臥式恒溫?fù)u床：常州杰博森儀器有限公司；LX-B35L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：濟(jì)南博華儀器有限公司；J-HH-6A型精密數(shù)顯恒溫水浴鍋：冠森生物科技（上海）有限公司；SPX-250數(shù)顯生化培養(yǎng)箱：上海昕儀儀器儀表有限公司；V5000型可見光分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WZ系列手持折光糖度計(jì)：浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度計(jì)：漳州市新奧光電儀器有限公司；2010QP-Plus型氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合龍眼果醋的工藝及操作要點(diǎn)

復(fù)合龍眼果醋的工藝主要包括鮮龍眼果汁制備、鮮檸檬果汁制備、龍眼檸檬復(fù)合果汁調(diào)配、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵及滅菌過濾等步驟等[15]，具體操作步驟見圖1。

圖1 復(fù)合龍眼果醋的工藝流程Fig.1 Technological process of compound longanfruit vinegar

龍眼汁的制備：鮮龍眼去皮去核取果肉后稱重，打漿榨汁后于龍眼汁中按龍眼果肉的重量，添加15 g/100 kg的偏重亞硫酸鉀；然后在龍眼汁中添加終濃度為0.2 g/L的果膠酶，45℃放置，酶解2小時(shí)后過濾[10]。

龍眼檸檬復(fù)合果汁調(diào)配：新鮮檸檬去皮去核取果肉打漿榨汁過濾后，不斷攪拌下添加于上述處理的龍眼汁中，不間斷測(cè)其pH值變化，當(dāng)pH值達(dá)到3.5時(shí)，完成復(fù)合龍眼檸檬汁調(diào)配。

酒精發(fā)酵得基酒：上述龍眼檸檬復(fù)合果汁加白砂糖調(diào)配初始糖度為22%，活性干酵母按產(chǎn)品說明書活化后按接種量15%接入，于22℃靜置發(fā)酵7天后得到復(fù)合龍眼果醋釀造基酒[6-11]。

醋酸發(fā)酵：將活化后的醋酸菌加入復(fù)合龍眼果酒中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，置于恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩發(fā)酵，7 d左右醋酸菌將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，乙酸不再變化時(shí)，發(fā)酵完成，復(fù)合龍眼果醋生成[12-14]。本研究中通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵階段的工藝。

滅菌過濾：采用巴氏消毒法（70℃，5 min）對(duì)復(fù)合龍眼果醋進(jìn)行滅菌，澄清后過濾。

1.2.2 復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵階段的單因素試驗(yàn)

以總酸含量為指標(biāo)，分別考察發(fā)酵溫度、基酒初始酒度、醋酸菌接種量及搖床轉(zhuǎn)速等因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響，試驗(yàn)于250 mL的錐形瓶中進(jìn)行，裝載量均為50 mL，每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其具體條件設(shè)置如下：

發(fā)酵溫度：基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵溫度設(shè)定為27、30、33、36、39℃，發(fā)酵7天后測(cè)定總酸含量，總酸（以乙酸計(jì)）采用酸堿滴定法測(cè)定。

基酒的初始酒度：發(fā)酵溫度33℃，醋酸菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，基酒的初始酒度設(shè)定為6%、8%、10%、12%、14%（體積比），發(fā)酵7天后測(cè)定總酸含量。

醋酸菌接種量：發(fā)酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，醋酸菌接種量設(shè)定為6%、8%、10%、12%和14%，發(fā)酵7天后測(cè)定總酸含量。

搖床轉(zhuǎn)速：發(fā)酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為120、140、160、180 r/min和200 r/min，發(fā)酵7天后測(cè)定總酸含量。

1.2.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝

由以上的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度（30、33、36℃）、基酒初始酒度（8%、10%、12%）、醋酸菌接種量（8%、10%、12%），進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝，試驗(yàn)于250 mL的錐形瓶中進(jìn)行，裝載量均為50 mL，試驗(yàn)重復(fù)3次，發(fā)酵7天后測(cè)定總酸含量，取其平均值作為優(yōu)化指標(biāo)。

1.2.4 復(fù)合龍眼果醋的質(zhì)量指標(biāo)評(píng)價(jià)

根據(jù)GB2719-2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)復(fù)合龍眼果醋的感官、理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]。

1.2.5 GC-MS分析復(fù)合龍眼果醋的風(fēng)味成分

萃取條件[17]：準(zhǔn)確量取5 mL果醋，移入10 mL鉗口樣品瓶中，加入2.00 g NaCl，聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上加熱至60℃，平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭頂空吸附 40 min，插入GC進(jìn)樣口解析5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC 條件[11]：DB-WAX 色譜柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm），進(jìn)樣口溫度為240℃，載氣為He，流速為1.83 mL/min，檢測(cè)器溫度為35℃。柱溫采用程序升溫方式：35℃保持3 min，以10℃/min升至115℃，保持3 min，然后以5℃/min升至235℃，保持10 min。

MS條件[11]：EI電子轟擊源，離子源溫度200℃，電離電壓70 eV，接口溫度250℃，掃描范圍45 m/z～450 m/z。

定性定量分析[18-19]：檢索質(zhì)譜自帶的NIST2.0和Wiley譜庫，再結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)各種香氣成分。采用峰面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對(duì)復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵階段的影響如圖2所示。

溫度對(duì)復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵影響顯著，30℃～36℃內(nèi)總酸含量較高（圖2A），因此，選取 30、33、36℃這3個(gè)溫度水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。從圖2B可以看出在8%～14%的基酒初始酒度范圍內(nèi)，復(fù)合龍眼果醋的總酸差異顯著，在8%～12%間復(fù)合龍眼果醋的總酸含量較高，因此，選取8%、10%、12%這3個(gè)基酒初始酒度水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。圖2C中可以看出，在8%～14%內(nèi)的醋酸菌接種量對(duì)復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵影響顯著，8%～12%的接種量范圍內(nèi)復(fù)合龍眼果醋的總酸含量較高，因而，選取8%、10%、12%這3個(gè)醋酸菌接種量水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。圖2D表明，在不同的轉(zhuǎn)速條件下，總酸含量的變化不顯著，因此，不選取發(fā)酵轉(zhuǎn)速作為正交試驗(yàn)的因素。

圖2 各因素對(duì)復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵階段的影響Fig.2 Effect of single factor on acetic acid fermentation for compound longan fruit vinegar

2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝的結(jié)果分析

正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)合龍眼果醋的醋酸發(fā)酵工藝的結(jié)果如表1所示。

表1 復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

續(xù)表1 復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

由表1可知，發(fā)酵溫度、基酒初始酒度和醋酸菌接種量這3個(gè)因素所對(duì)應(yīng)的極差（R）大小順序?yàn)椋築＞C＞A，從而得知影響復(fù)合龍眼果醋醋酸發(fā)酵的主次因素依次為基酒初始酒度、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度。

而k1、k2、k3分別為各因素各水平所對(duì)應(yīng)的總酸含量的平均值，由表1可知，在 A 因素中，k2＞k1＞k3；在 B因素中，k2＞k3＞k1；在 C 因素中，k3＞k2＞k1。因此，各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序是：A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，由此可得出復(fù)合龍眼果醋的釀造工藝的最優(yōu)方案為A2B2C3。

綜合分析，最終確定復(fù)合龍眼果醋的釀造工藝的最佳組合方案是A2B2C3，即發(fā)酵溫度為33℃、基酒的初始酒度10%、醋酸菌接種量12%。在此條件，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為，復(fù)合龍眼果醋的總酸含量為（6.80±0.06）g/100 mL。

2.3 復(fù)合龍眼果醋的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 復(fù)合龍眼果醋的感官指標(biāo)

復(fù)合龍眼果醋感官指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合龍眼果醋的感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation of compound longan fruit vinegar

結(jié)果表明，以龍眼和檸檬為原料采用最佳醋酸發(fā)酵工藝釀制而成的復(fù)合龍眼果醋產(chǎn)品色澤金黃亮麗，酸味柔和，口感上佳，體態(tài)透明清澈無沉淀，具有特有的果香和醋香。該復(fù)合龍眼果醋感官指標(biāo)符合GB 18187-2000《釀造食醋》。

2.3.2 龍眼檸檬汁、復(fù)合龍眼果酒、復(fù)合龍眼果醋理化成分指標(biāo)比較

對(duì)復(fù)合龍眼果醋中總酸含量、總糖、還原糖進(jìn)行測(cè)定，得出復(fù)合龍眼果醋的理化指標(biāo)，結(jié)果見表3。

表3 龍眼檸檬汁、復(fù)合龍眼果酒、復(fù)合龍眼果醋的理化成分指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of longan-lemon juice，fruit wine and compound fruit vinegar

通過這3種物質(zhì)的對(duì)比，復(fù)合龍眼果醋的總酸符合國家標(biāo)準(zhǔn)，相對(duì)于其他的兩樣物質(zhì)，果醋的總酸含量是最高的，總糖與還原糖的含量相較于復(fù)合龍眼果酒也略高，因此，復(fù)合龍眼果醋的營養(yǎng)價(jià)值更高，更符合人們健康理念。

2.3.3 復(fù)合龍眼果醋的微生物指標(biāo)

復(fù)合龍眼果醋微生物指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果見表4，表明復(fù)合龍眼果醋微生物指標(biāo)均符合GB2719-2003。

表4 復(fù)合龍眼果醋的微生物指標(biāo)Table 4 Microbial indicators of compound longan fruit vinegar

2.4 復(fù)合龍眼果醋風(fēng)味成分的GC-MS結(jié)果分析

復(fù)合龍眼果醋中各組分質(zhì)譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫檢索及結(jié)合文獻(xiàn)資料分析，鑒定出21種風(fēng)味物質(zhì)，按照出峰時(shí)間順序列出，見表5。

表5 復(fù)合龍眼果醋風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis results of flavor substances of compound longan vinegar

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，復(fù)合龍眼果醋的風(fēng)味成分由醇類物質(zhì)（8種）、烴類物質(zhì)（4種）、酯類物質(zhì)（4種）、酸類物質(zhì)（3種）及醛酮類物質(zhì)（2種）組成。其中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量最高，為72.82%；其余依次為，烴類物質(zhì)9.08%，酯類物質(zhì)8.56%，醛酮類物質(zhì)6.81%，酸類物質(zhì)2.71%。

復(fù)合龍眼果醋的風(fēng)味物質(zhì)中，相對(duì)含量較多的均為醇類，其相對(duì)含量及呈香分析如下：4-萜烯醇（18.35%）呈胡椒香味，alpha-松油醇（15.38%）呈熏衣草香味，3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇（13.42%）呈沉香味，（-）-4-萜品醇（9.2%）呈丁香味及香茅醇（8.27%）呈玫瑰香味等。

4種酯類物質(zhì)相對(duì)含量均大于1%，其中：（Z）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（橙花乙酸酯）相對(duì)含量最高（4.26%），呈橙花和玫瑰香氣及蜂蜜和覆盆子甜香味；其次為反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（乙酸香葉酯），相對(duì)含量1.91%，有玫瑰和熏衣草香氣；甲酸異戊酯相對(duì)含量1.31%，有特殊香味；乙酸苯乙酯（1.08%）呈玫瑰花香，帶蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香，并帶有可可和威士忌樣的香韻。

上述醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是復(fù)合龍眼果醋風(fēng)味的主要成分，是醋體芬芳飄香的保證[20]；另外其他的烴類、醛酮類、酸類物質(zhì)也是復(fù)合龍眼果醋風(fēng)味的重要組成部分，使得復(fù)合龍眼果醋酸味爽快、柔和，是果醋香氣不可缺少的重要物質(zhì)。上述多種香氣成分比例協(xié)調(diào)適宜，造就了復(fù)合龍眼果醋飽滿的香氣和獨(dú)特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

復(fù)合龍眼果醋的最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量12%，該工藝發(fā)酵所得復(fù)合龍眼果醋總酸可達(dá)6.80 g/100 mL。所制得復(fù)合龍眼果醋的感官、理化和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，具有獨(dú)特風(fēng)味。復(fù)合龍眼果醋的主要風(fēng)味物質(zhì)為醇類（4-萜烯醇、alpha-松油醇、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、（-）-4-萜品醇及香茅醇）、酯類（橙花乙酸酯、乙酸香葉酯、甲酸異戊酯及乙酸苯乙酯）等。相對(duì)于龍眼果實(shí)的風(fēng)味成分烯烴類[21]，龍眼果酒的主要風(fēng)味物質(zhì)醇類（2，3-丁二醇、苯乙醇）及酯類（乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯及 1，4-丁內(nèi)酯）[11]，復(fù)合龍眼果醋的主要風(fēng)味物質(zhì)有顯著差異，表現(xiàn)出其獨(dú)特風(fēng)味。