芒果果皮多糖酶法提取及其體外抗氧化活性

趙仕花，盧明順，巫楚軍，農(nóng)貴珍，陳曉白，蔣德旗，2，*

（1.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林537000；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西玉林537000）

芒果（Mangifera indica L.）屬于漆樹(shù)科植物，主要分布在我國(guó)廣西、海南、云南等地，其中芒果葉富含黃酮和酚酸類(lèi)等，芒果果實(shí)富含糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素等活性成分[1-2]，具有多種藥理作用，如芒果苷抗氧化與調(diào)節(jié)糖脂代謝、止咳平喘等[3-5]?，F(xiàn)有研究主要針對(duì)芒果葉部位的有效成分，而對(duì)芒果果實(shí)、樹(shù)皮等化學(xué)成分和藥理作用的研究尚少。果皮是芒果食用及加工過(guò)程中的廢棄物，研究發(fā)現(xiàn)芒果皮提取物可以改善高脂血癥模型大鼠血脂水平和肝功能，并具有一定的抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[6]。為提高芒果資源綜合利用率及進(jìn)一步了解芒果多糖的生物活性，本研究探討纖維素酶提取芒果果皮多糖的最佳條件，并研究其體外抗氧化活性，為芒果果皮多糖開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果：品種為桂七芒，市售，本研究取其干燥果皮作為材料；纖維素酶（食品級(jí)，5萬(wàn)U/g）、維生素C、D-無(wú)水葡萄糖：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：日本TCI公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

5810R型高速離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司；Alpha-1506型紫外分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器：常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHB-III型循環(huán)水真空泵、2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海皓莊儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芒果果皮多糖提取

多糖提取具體操作方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，主要包括粉碎、特定酶解條件下提取、高溫滅活、分離濃縮、乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白、二次醇沉、真空冷凍干燥等系列步驟。

1.2.2 多糖含量測(cè)定

多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=8.498 6x-0.018 5，R2=0.990 3，式中 y為 490 nm條件下的吸光度值、x為葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）。多糖得率/%=cnV/m×100。

式中：c為樣品稀釋液中多糖的濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品稀釋液體積mL；m為芒果果皮粉末質(zhì)量，mg。

1.2.3 多糖提取單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)搖床轉(zhuǎn)速固定為180 r/min，分別考察pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、液料比[4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1（mL/g）]、酶添加量（2、6、10、14、18 mg/mL）、酶解時(shí)間（40、80、120、160、200 min） 和酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對(duì)芒果果皮多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH 5.0、液料比 8∶1（mL/g）、酶添加量10 mg/mL、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度45℃。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，自變量包括酶解pH值、酶解時(shí)間、酶添加量、液料比4個(gè)因素，以多糖得率為響應(yīng)值。數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.06軟件。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)及水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.5 芒果果皮多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度A1，同法測(cè)定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0，以維生素C作為對(duì)照，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率 Y/%=[1-（A1-A2）/A0]×100[7]。

1.2.5.2 ·OH清除能力測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的樣品提取液2 mL，依次加入濃度均為5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入5 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，混勻，37℃水浴30 min后，波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度B1，用蒸餾水代替水楊酸測(cè)定吸光度B2，以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定吸光度B0，以維生素C作為對(duì)照，樣品對(duì)·OH 的清除率 Y/%=[1-（B1-B2）/B0]×100[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)芒果果皮多糖得率的影響

纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Influence of cellulase addition amount on the polysaccharide extraction rate

由圖1可知，當(dāng)酶添加量增加到10 mg/mL時(shí)，多糖得率可達(dá)4.37%，進(jìn)一步加大酶用量，多糖得率沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明在該底物濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，繼續(xù)增加纖維素酶用量，對(duì)多糖得率沒(méi)有顯著影響，選擇10 mg/mL作為酶的最佳添加量。

pH值對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH value on the polysaccharide extraction rate

由圖2可知，當(dāng)pH值增加到5.0時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值4.45%，pH=7.0時(shí)多糖得率反而降低，酶解最佳pH值選定為5.0。

液料比對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)液料比增加到 8∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率達(dá)到4.31%，之后，隨著液料比增大，多糖得率反而減小，原因可能與過(guò)高液料比不利于多糖物質(zhì)溶出有關(guān)，此外，水用量過(guò)大加重后續(xù)濃縮工作負(fù)擔(dān)，不利于工業(yè)化實(shí)際生產(chǎn)，故液料比優(yōu)化為8∶1（mL/g）。

酶解溫度對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖3 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Influence of the ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate

圖4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Influence of hydrolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

由圖4可知，隨著溫度的升高，多糖得率先提高后降低，這是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酶活力減弱所致，選擇45℃為本研究最佳酶解溫度。

酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Influence of hydrolysis time on the polysaccharide extraction rate

由圖5可知，當(dāng)酶解時(shí)間為80 min時(shí)，多糖得率4.34%接近120 min時(shí)的最大值4.37%，本研究選擇80 min為最佳酶解時(shí)間。

2.2 芒果果皮多糖纖維素酶提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 芒果果皮多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

表3 芒果果皮多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

續(xù)表3 芒果果皮多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Continue table 3 Variance analysis of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，獲得自變量（酶解pH值、酶解時(shí)間、酶添加量、液料比）與芒果果皮多糖得率（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=4.55-0.031A+0.83B+0.14C-0.17D+0.01AB-0.40AC+0.24AD+0.037BC-0.10BD-0.39CD-0.76A2-0.14B2-0.65C2-0.94D2。由表3可知，回歸方程模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著（P=0.065 4），模型總決定系數(shù)R2=0.974 3，調(diào)整后R2Adj=0.948 6，以上參數(shù)均說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，可用于不同變量條件下的響應(yīng)值預(yù)測(cè)。

由表3F值可知，芒果果皮多糖纖維素酶法提取影響因素的主次順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間（B）＞液料比（D）＞酶添加量（C）＞酶解pH值（A），其中A影響不顯著，其它三因素均達(dá)到顯著水平。因素間交互作用對(duì)芒果果皮多糖得率的影響如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graphs showing the interactions of various factors on polysaccharide yield

由圖6（b、c、f）和表3方差分析結(jié)果可知，AC、AD、CD交互作用顯著影響芒果果皮多糖酶法提取的得率，其中AC、CD達(dá)到非常顯著水平，AD達(dá)到顯著水平，其它兩因素間交互作用對(duì)多糖得率的影響均不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 最佳提取條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

對(duì)回歸模型方程求解，獲得芒果果皮多糖纖維素酶提取的最佳條件為酶解pH4.9，酶解時(shí)間100.0 min，酶添加量 10.46 mg/mL，液料比 7.6 ∶1（mL/g），此條件下多糖得率為5.28%。考慮實(shí)際操作方便，將上述最佳提取參數(shù)修改為酶解pH值5.0，酶解時(shí)間100.0 min，酶添加量 10.5 mg/mL，液料比 7.6 ∶1（mL/g），根據(jù)工藝條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得多糖得率平均值為（5.17±0.64）%，與回歸方程理論多糖得率5.28%的相對(duì)誤差為2.08%，提示本響應(yīng)面法得到的回歸模型有效、可靠，得到的纖維素酶提取芒果果皮多糖工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 芒果果皮多糖體外抗氧化活性

2.3.1 芒果果皮多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

芒果果皮多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖7。

圖7 芒果果皮多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of polysaccharide from Mangifera indica L.rind on DPPH radical

由圖7可知，當(dāng)芒果果皮多糖濃度在0.2 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率不斷增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，芒果果皮多糖對(duì)DPPH自由基清除率為90.14%，而維生素C對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)95.13%，芒果果皮多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為1.385 mg/mL，維生素C的IC50為0.716 mg/mL，兩者比較，芒果果皮多糖清除能力弱于維生素C。以上結(jié)果提示芒果果皮多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。

2.3.2 芒果果皮多糖對(duì)·OH清除作用

芒果果皮多糖對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)圖8。

圖8 芒果果皮多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Mangifera indica L.rind on hydroxyl radical

由圖8可知，當(dāng)芒果果皮多糖濃度在0.2 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率穩(wěn)步提升，而維生素C在濃度6 mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率就已達(dá)到最大值95.08%，之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，芒果果皮多糖對(duì)·OH清除率為89.24%，維生素C對(duì)·OH清除率可達(dá)94.69%，芒果果皮多糖清除·OH的IC50為3.612 mg/mL，維生素C的IC50為0.587 mg/mL，兩者比較，維生素C清除能力強(qiáng)于芒果果皮多糖。以上結(jié)果說(shuō)明芒果果皮多糖具有較好的·OH清除作用。

3 結(jié)論討論

天然植物多糖越來(lái)越受到學(xué)者的重視，主要因?yàn)槠渚哂卸喾N藥理活性，如抗炎、抗氧化、提供免疫功能等，還具有毒副作用低等特點(diǎn)。天然產(chǎn)物多糖來(lái)自于植物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁的天然高分子化合物，可采用有機(jī)溶劑、酶解等方法提取，其中酶解提取操作簡(jiǎn)單、條件較溫和，在多糖結(jié)構(gòu)研究以及活性保持方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[9]。植物多糖具有抗腫瘤、抗病毒、防衰老、降血糖等生物活性，可作為藥物和保健品的有效成分，藥食兩用植物多糖系列產(chǎn)品的市場(chǎng)前景將非常廣闊[10-11]。

芒果果皮約占整個(gè)鮮果的15%左右，果皮作為加工副產(chǎn)物，在企業(yè)生產(chǎn)中都作為廢棄物丟棄，對(duì)環(huán)境造成污染還浪費(fèi)資源。芒果果皮中富含多糖、膳食纖維、苷類(lèi)、揮發(fā)油等功效成分[12-14]，具有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)脂代謝等作用[15-16]。研究表明，采用熱水浸提、乙醇沉淀法提取芒果不同部位多糖，其中果實(shí)多糖含量達(dá)到4.6%[2]，葉中多糖含量為1.5%[17]。林燕如等還使用超聲波輔助乙醇沉淀法提取芒果葉中多糖，提取量為1.0%[18]，對(duì)芒果有效成分多糖的研發(fā)將有助于提升其附加值。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了芒果果皮多糖纖維素酶提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)芒果果皮多糖得率影響最顯著，其次是液料比、酶添加量，而酶解pH值對(duì)其多糖提取影響最??；芒果果皮多糖最佳酶解提取條件為酶解pH5.0，酶解時(shí)間 100.0 min，酶添加量 10.5 mg/mL，液料比7.6∶1（mL/g）、酶解溫度45℃，在此條件下芒果果皮多糖的得率為5.17%，與回歸模型方程預(yù)測(cè)值5.28%相比，相對(duì)誤差小于5%。張莉等采用超聲波輔助乙醇沉淀法提取芒果皮渣中多糖，結(jié)果表明在提取溫度80℃、超聲功率160 W、提取時(shí)間90 min、料液比1∶2（g/mL）、提取次數(shù)2次的條件下，芒果皮渣多糖得率為0.81%[19]，此外，王維民等研究表明芒果皮中粗多糖得率可達(dá)3.5%[20]，均低于本研究中酶法提取的多糖得率。

通過(guò)體外抗氧化活性試驗(yàn)，芒果果皮多糖對(duì)DPPH自由基、·OH均具有較強(qiáng)的清除能力，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度下其對(duì)兩種自由基的清除能力均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系，與張莉等研究結(jié)果一致[19]。芒果果皮多糖清除DPPH自由基的IC50為1.385 mg/mL，清除·OH的IC50為3.612 mg/mL。但與維生素C比較，芒果果皮多糖清除兩種自由基的能力較弱。以上研究結(jié)果可為芒果果皮多糖的研究開(kāi)發(fā)提供一定的前期理論基礎(chǔ)。