陽荷揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析

蔡依，徐津林，郭百臻，李肖，段金輝，阮金蘭，*

（1.武昌理工學院生命科學學院，湖北武漢430223；2.武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北武漢430073）

陽荷系姜科姜屬多年生草本植物（Zingiber striolatum Diels），廣泛分布四川、貴州、廣西、湖北、湖南、江西、廣東等地[1]；生于林蔭下、溪邊，海拔300 m～1 900 m。陽荷是野生蔬菜，一年種植多年生長，能經(jīng)受較惡劣的環(huán)境磨煉，生命力極強，基本上無病蟲害，無須使用農(nóng)藥，且多地均有栽培。陽荷[2]是食藥同源，嫩芽、莖果味道香甜，可直接烹飪食用，富含有豐富的膳食纖維、必需氨基酸和蛋白質(zhì)等，具有活血、化瘀、降血糖、治療痛經(jīng)[3]等作用?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外對陽荷的研究主要集中在膳食纖維、紅色素、多糖和降血糖等方面[4-6]，對陽荷揮發(fā)油相關的報道甚少。揮發(fā)油[7]又稱精油，是天然植物的活性成分之一，具有分子量小，可隨水蒸氣蒸出等特點，其化學成分復雜，具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抑菌和抗腫瘤等作用[8-9]。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)陽荷提取物能明顯地降低糖尿病實驗動物的血糖，極具深入研究價值，本試驗采用單因素試驗、多因素多水平的正交試驗、超聲輔助蒸餾法提取陽荷揮發(fā)油[10]并優(yōu)化陽荷揮發(fā)油的提取工藝，氣相色譜-質(zhì)譜（gass chromatography-mass spectormetry，GC-MS） 分析陽荷揮發(fā)油的化學成分，以期為陽荷的深入研究與開發(fā)，充分發(fā)掘陽荷資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽荷：湖北省恩施利川現(xiàn)代農(nóng)業(yè)公司，經(jīng)本課題組阮金蘭教授鑒定為陽荷Zingiber striolatum Diels。

無水乙醚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；ZNHW型電熱套：上海越眾儀器設備有限公司；TQ10超純水機：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)油的提取

提取方法[11]：本試驗采用超聲輔助蒸餾提取法提取陽荷揮發(fā)油，并計算揮發(fā)油的提取率，提取率/%=揮發(fā)油重量（g）/陽荷重量（g）×100。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 超聲時間的考察

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入純化水，攪拌均勻，分別超聲30、40、50、60、70 min，然后蒸餾提取3 h，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發(fā)油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.2.2 蒸餾時間的考察[12]

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入純化水，攪拌均勻，用1.3.2.1中的最佳超聲時間超聲，分別蒸餾 1、2、3、4、5 h，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發(fā)油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.2.3 料液比的考察

準確稱取100 g打漿后的陽荷5份，分別以1∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5、1 ∶3、1 ∶3.5（g/mL）的料液比加入純化水，以1.3.2.1中的最佳超聲時間超聲，用1.3.2.2中的最佳蒸餾時間蒸餾提取，收集蒸餾液，分別用無水乙醚萃取揮發(fā)油，回收乙醚完全以后計算提取率。

1.3.3 正交試驗[13]

在1.3.2中的單因素試驗的基礎上，選取提取時間、料液比及超聲時間3個影響因素，以揮發(fā)油提取率為評價指標，采用三因素三水平的正交試驗方法進行正交試驗，并進行比較試驗，確定最佳提取工藝。

1.3.4 驗證試驗[14]

為保證工藝的重復性和可行性，對最佳提取工藝進行驗證試驗，以陽荷揮發(fā)油提取率為評價指標，并計算RSD值。

1.3.5 GC-MS分析[15-17]

色譜條件：DB-5MS色譜柱（0.24 mm×30 m，0.25 μm），載氣為氦氣，進樣口溫度為250℃，流速為1.0 mL/min，程序升溫，進樣量為0.2 μL。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度260℃，接口溫度為260℃，全掃描采集，掃描范圍m/z40～600。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫為NIST4.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響

超聲時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖1所示，隨著超聲時間的增加，陽荷揮發(fā)油的提取率逐漸升高，在超聲60 min時達到峰值，提取率達到0.031 2%，超聲時間超過60 min后揮發(fā)油提取率開始下降。因此，確定較佳超聲時間為60 min。

2.1.2 蒸餾時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響

蒸餾時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響見圖2。

圖2 蒸餾時間對陽荷揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Influence of distillation time on the extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖2所示，隨著蒸餾時間的增加，陽荷揮發(fā)油的提取率逐漸升高，在蒸餾4 h時達到峰值，提取率達到0.027 6%，蒸餾時間超過4 h后揮發(fā)油提取率開始下。因此，確定較佳蒸餾時間為4 h。

2.1.3 料液比對陽荷揮發(fā)油提取率的影響

料液比對陽荷揮發(fā)油提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對陽荷揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

如圖3所示，隨著料液比的增加，提取率逐漸升高，在1∶3（g/mL）時達到峰值，陽荷揮發(fā)油提取率達到0.026 6%，在1∶3.5（g/mL）后提取率開始下降。因此，較佳料液比為 1 ∶3（g/mL）。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交因素水平表的設計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計L9（33）表，以陽荷揮發(fā)油的提取率為綜合評價指標，因素水平安排見表1，正交試驗結(jié)果見表2和表3。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiments

對上述正交試驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析，K值越大表示該水平對提取率的影響越大，影響陽荷揮發(fā)油提取率的主次因素為A＞C＞B，即超聲時間＞料液比＞蒸餾時間。通過比較K值，選擇K值最大的因素水平即為最佳提取工藝，最佳提取方案是A3B2C2。

依據(jù)正交試驗結(jié)果，依次對A、B、C 3個因素進行方差分析[18]，分別計算離差平方和、自由度、均方、F和P。由表3分析可知，因素A對陽荷揮發(fā)油的提取率有決定性影響，因素B和因素C對陽荷揮發(fā)油的提取率均無顯著性影響。

2.3 比較試驗

將最佳提取工藝A3B2C2，與正交表中第8組A3B2C1進行比較試驗，結(jié)果見表4。

表4 比較試驗Table 4 Comparison experiments

正交表優(yōu)選方案A3B2C2提取率高于正交表中第8組A3B2C1的提取率，因此最佳提取方案是A3B2C2，超聲 60 min，蒸餾時間 4 h，料液比為 1 ∶3（g/mL）。

2.4 驗證試驗

以正交試驗的最優(yōu)化方案A3B2C2提取陽荷揮發(fā)油，重復3次，結(jié)果如表5所示。

表5 驗證試驗Table 5 Validation experiment

圖4 陽荷揮發(fā)油總離子流色譜Fig.4 Total ion chromatogram of volatile oil from Zingiber striolatum Diels

表6 陽荷揮發(fā)油成分及相對含量Table 6 Composition and relative content of the volatile oil of the Zingiber striolatum Diels

陽荷揮發(fā)油提取率分別為0.036 8%、0.036 4%和0.035 9%，RSD值等于1.23%，證明優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行，重復性好。

2.5 陽荷揮發(fā)油化學成分分析

采用GC-MS技術對陽荷揮發(fā)油進行成分分析，獲得總離子流色譜圖，見圖4。從陽荷揮發(fā)油中鑒定出17種物質(zhì)，結(jié)果見表6。

所得揮發(fā)油大多為烯烴類組分，其中含量較高的有棕櫚酸（30.508%）、β-水芹烯（12.359%）、芥酸酰胺（7.376%）、α-律草烯（6.501%）、正十七烷（4.830%）、亞油酸（4.147%）、亞麻酸甲酯（3.242%）、β-蒎烯（3.065%）、4-（1-甲基乙基）-2-環(huán)己烯-1-酮（2.196%）。

王軍民等[19]采用水蒸氣蒸餾法提取陽荷揮發(fā)油，提取率高達2.605%，共鑒定出55個化學成分，占化合物總數(shù)的93%，含量較高的有檸檬烯（26.695%）、α-蒎烯（3.683%）、β-蒎烯（4.292%）、α-石竹烯（5.328%）等，與本試驗的陽荷揮發(fā)油提取率和揮發(fā)油成分差異較大。王軍民等所使用的陽荷采自云南省西疇縣，本試驗所使用的陽荷采自湖北恩施。王軍民等采用單一水蒸氣蒸餾法、石油醚萃取揮發(fā)油，本試驗采用超聲輔助蒸餾提取法、無水乙醚萃取。后期本課題組將購買云南省西疇縣所產(chǎn)陽荷，通過試驗比較不同產(chǎn)地、提取方法、萃取溶劑對陽荷揮發(fā)油、化學成分的影響。

3 結(jié)論

揮發(fā)油是陽荷的主要化學成分類別之一，具有廣泛的生理活性，隨著天然植物現(xiàn)代化的深入開展，揮發(fā)油的成分分析成為熱點之一。本試驗通過單因素試驗和多因素多水平的正交試驗對陽荷揮發(fā)油的提取工藝進行了研究。應用GC-MS技術分析了陽荷揮發(fā)油的主要化學成分，得到了最佳提取工藝為：超聲60 min，蒸餾時間 4 h，料液比為 1 ∶3（g/mL）。在此提取條件下陽荷揮發(fā)油提取率可達到0.036 8%，提取方法可行，具有簡單快捷的特點。通過GC-MS數(shù)據(jù)庫共鑒定出所得揮發(fā)油中17個主要化學成分，其中8個是烯烴類化合物，棕櫚酸含量高達30.508%。本試驗優(yōu)化了陽荷揮發(fā)油的提取工藝，采用GC-MS技術分析了陽荷揮發(fā)油主要成分，為陽荷資源合理開發(fā)提供了科學試驗依據(jù)。