烤肉中糖對(duì)雜環(huán)胺形成的影響及其作用機(jī)制研究

韓中惠，王曉敏，吳士瑩，張燕

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白質(zhì)的食物在熱加工過程中形成的具有多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)的致癌致突變物的一類化合物。到目前為止，已經(jīng)從熱加工的肉類中分離鑒定了30多種的雜環(huán)胺[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明這些雜環(huán)胺具有增加罹患結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）把 PhIP、A&C、MeA&C、MeIQx、8-MeIQx、Trp-P-1、Trp-P-1和Glu-P-1列為2B類可能致癌物，把IQ等列為2A類致癌物[5]。

糖可以作甜味劑、調(diào)味劑、增稠劑、著色劑等，在肉制品加工中它也得到了廣泛的使用。所以深入研究肉制品中的糖對(duì)于雜環(huán)胺形成的影響具有十分重要的意義。最近研究人員發(fā)現(xiàn)在腌肉汁的配方中添加不同種類的糖會(huì)抑制烤雞肉大多數(shù)雜環(huán)胺（MeIQ，DiMeIQx，IQ，IQx，Norharman 和 Harman）的形成[6]；蜂蜜中存在的糖類物質(zhì)可以有效抑制牛肉中雜環(huán)胺的形成[7]。雖然關(guān)于糖對(duì)雜環(huán)胺形成的影響已經(jīng)有很多報(bào)道[8-10]，但是他們對(duì)于造成這些結(jié)果的原因并沒有給出明確的解釋說明。

糖在肉制品熱加工過程中不僅可以發(fā)生焦糖化反應(yīng)，也可以與肉中的氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)。而α-二羰基化合物恰好是焦糖化和美拉德反應(yīng)中重要的中間體，且α-二羰基化合物具有高度的化學(xué)活性，易進(jìn)一步發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)[11-14]。在肉制品中雜環(huán)胺的形成與美拉德等相關(guān)反應(yīng)密切相關(guān)，所以肉制品中糖對(duì)雜環(huán)胺形成產(chǎn)生的影響可能與α-二羰基化合物存在密切的關(guān)系。但是目前，僅有糖對(duì)雜環(huán)胺形成影響的報(bào)道，沒有關(guān)于其與α-二羰基化合物存在關(guān)系的報(bào)道。

本文采用常見的烤肉食品體系，分析加工過程中糖的種類對(duì)雜環(huán)胺形成的影響，并探討作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx標(biāo)準(zhǔn)品（98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；丙酮醛（40%水溶液）、乙二醛（40%水溶液）、丁二酮、3-脫氧葡萄醛酮和葡萄糖醛酮：美國Sigma-Aldrich公司；甲酸銨、乙酸銨（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二胺：上海阿拉丁生化科技有限公司。

試驗(yàn)所需的豬肉（土豬1號(hào)黑豬肉）自天津市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)樂購超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6410型高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer，HPLC-MS/MS）、Agilent 7890B/977A型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國 Agilent公司；LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本Shimadzu公司；12通道固相萃取儀：美國Sigma-Aldrich公司；RCT BS 25型磁力攪拌器和MS 3型渦旋混合器：德國IKA公司；FE20K型PH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R型離心機(jī)：美國Beckman公司；MGS-2200型氮吹儀：日本東京理化公司；GR18烤箱：中國瀾鑫電烤箱公司；固相萃取柱HyperSep C18（200 mg/5 mL）：美國 Thermo Scientific 公司；固相萃取柱 Si-SCX-2（200 mg/5 mL）：美國 SILICYCLE公司；固相萃取柱HLB：美國waters公司。

1.3 樣品的制備

烤肉的加工流程如下：

新鮮的肉→絞肉機(jī)絞碎→稱取30 g→分別加入不同種類的糖或者α-二羰基化合物→混合均勻→將肉壓制成直徑10 cm的圓形餅→使用油烤箱在一定溫度時(shí)間下加工→樣品

葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的加入量分別為0.75、1.5、2.25 g和3 g，考察糖的種類及添加量對(duì)雜環(huán)胺形成和α-二羰基化合物形成的影響。

烤箱烤制的溫度為180℃，烤制的時(shí)間為30 min。溫度的控制±2℃范圍內(nèi)，時(shí)間以秒表準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次?？局茰囟葧r(shí)間的是根據(jù)實(shí)際的食品加工情況設(shè)定的。

1.4 雜環(huán)胺的檢測

1.4.1 樣品前處理

在先前已有方法上進(jìn)行改進(jìn)，試驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[15-16]。首先，將一定量的碎肉加入氧氧化鈉溶液和甲醇均質(zhì)，并與硅藻土混合，用二氯甲烷洗脫；其次，將洗脫采用丙磺酸陽離子（Si-SCX-2）交換柱和C18固相萃取柱串聯(lián)萃?。蛔詈?，將樣品洗脫液用氮?dú)獯蹈扇缓笥? mL色譜純甲醇復(fù)溶、稀釋，再離心、過0.22 μm有機(jī)微孔過濾膜，將制得樣品暫存4℃下備用。

1.4.2 雜環(huán)胺分析方法

1.4.2.1 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為 ZorbaxEclipsePlusC18（2.1mm×150mm，3.5 μm）；柱溫為 25 ℃；流速為 0.2 mL/min；流動(dòng)相：A為甲酸銨（10 mol/L，pH=3.5），B 為乙腈；洗脫梯度為：0～12 min，10%～60%（B）；12 min～14 min，60%～10%（B）；進(jìn)樣的體積為 1 μL。

1.4.2.2 質(zhì)譜（MS）條件

該質(zhì)譜使用的離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；其霧化和碰撞的氣為氮?dú)?；霧化氣壓力為0.28 MPa；毛細(xì)管電壓為4 000 V；干燥器流量為10 L/min；干燥器溫度為350℃；檢測模式為多重反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）。雜環(huán)胺的質(zhì)譜躍遷模式分別為：PhIP，m/z 225.3→m/z 210；IQ，m/z 199.2→m/z 184.2；MeIQ，m/z 213.3→m/z 198.2；MeIQx，m/z 214.3→m/z 199.2。

1.5 α-二羰基化合物的檢測

1.5.1 樣品前處理

參考文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[17]。首先，取一定量的肉樣，加入適當(dāng)?shù)乃?甲醇（1/1，體積比）。其次，移取一定量的上清液，向上清液中加入衍生試劑鄰苯二胺（40 mg/mL）溶液水浴。最后，將衍生后的樣品經(jīng)固相萃取柱（HLB柱）純化，洗脫液過有機(jī)濾膜（0.22 μm）備用。

1.5.2 α-二羰基化合物分析方法

1.5.2.1 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為 Polar-RP 80 A （2 mm×150 mm，4 μm）柱；柱溫設(shè)定為25℃；進(jìn)樣體積設(shè)為5 μL流動(dòng)相的流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相選擇0.1%甲酸水溶液為A相，甲醇為B相；洗脫的程序如下表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elute program of mobile phase

1.5.2.2 質(zhì)譜（MS）條件

離子源為ESI；霧化氣和碰撞氣為氮?dú)猓混F化氣壓力為0.28 Mpa；干燥器溫度為350℃；干燥器流量為10 L/min；毛細(xì)管電壓為4 000 V；檢測模式為MRM。α-二羰基化合物被鄰苯二胺衍生后的質(zhì)譜躍遷模式分別為：MGO，m/z 145.1→m/z 77；GO，m/z 131.1→m/z 77；2，3-BD，m/z 159.2→m/z 131；3-DG，m/z 235.2→m/z 199.1；GS，m/z 251.2→m/z 173。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示。其相關(guān)數(shù)據(jù)通過方差分析（analysis of variance，ANOVA）和鄧肯測試（Duncan test）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件為IBM SPSS 19.0。作圖軟件為OriginPro 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法驗(yàn)證

為了保證試驗(yàn)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)雜環(huán)胺和α-二羰基化合物的檢測方法進(jìn)行了詳細(xì)的方法學(xué)考察。其中考察的指標(biāo)包括線性回歸方程、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantilty，LOQ）回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。雜環(huán)胺標(biāo)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)r2值如下表2。

表2 雜環(huán)胺的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for HAAs

樣品中雜環(huán)胺的檢出限LOD和定量限LOQ也在表2顯示。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP在樣品的回收率分別為78.4%～82.0%，76.8%～82.3%，85.4%～89.3%和75.1%～81.3%。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%～4.5%，3.1%～4.2%，1.4%～3.7%和3.7%～5.2%。結(jié)果表明雜環(huán)胺各濃度水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能達(dá)到檢測要求，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，適用于本試驗(yàn)檢測。

α-二羰基化合物標(biāo)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)r2值如下表3。

表3 α-二羰基化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 3 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for α-DCs

樣品中α-二羰基化合物的檢出限LOD和定量限LOQ也在表3顯示。MGO，GO，2，3-BD，3-DG和GS在樣品的回收率分別為84.8%～90.2%，86.8%～94.8%，87.5%～89.4%，94.8%～97.1%和87.4～89.8%。此外，MGO，GO，2，3-BD，3-DG 和 GS的在樣品中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 2.1%～4.7%，2.3%～4.0%，2.4%～5.5%，3.2%～4.2%和1.4%～3.5%。結(jié)果表明α-二羰基化合物各濃度水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能達(dá)到檢測要求，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。從以上的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，測定雜環(huán)胺和α-二羰基化合物的方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，符合本研究的要求。

2.2 不同種類的糖對(duì)烤肉中雜環(huán)胺形成的影響

不同種類的糖對(duì)烤肉中雜環(huán)胺形成的影響見圖1。

圖1 不同種類的糖對(duì)烤肉中雜環(huán)胺形成的影響Fig.1 Effect of sugars on the formation of HAAs in oven roasted pork

從圖1a可以看出，隨著葡萄糖添加量的逐漸增加，生成雜環(huán)胺的總量以及PhIP、IQ、MeIQx和MeIQ的量均逐漸降低（p＜0.05），當(dāng)糖的添加量在1.5 g時(shí)，各個(gè)雜環(huán)胺的生成量顯著降低（p＜0.05）；在最大添加量時(shí)，雜環(huán)胺的降低率均都達(dá)到85%以上。

4種添加糖類相比，果糖對(duì)各雜環(huán)胺的影響與葡萄糖的結(jié)果相似，4種雜環(huán)胺的含量均隨著果糖添加量的增加而降低（圖1b）；添加蔗糖時(shí)，4種雜環(huán)胺在一定程度上降低，但降低程度明顯低于葡萄糖和果糖（圖1c）；蜂蜜也會(huì)對(duì)這幾種雜環(huán)胺的形成產(chǎn)生影響，作用效果強(qiáng)于蔗糖，低于葡萄糖和果糖（p＜0.05）（圖1d）。從雜環(huán)胺被抑制程度看，這四種雜環(huán)胺中，PhIP被抑制的程度最高，IQ的最低。這種現(xiàn)象的形成可能與不同雜環(huán)胺之間的前體物密切相關(guān)。

2.3 不同種類的糖對(duì)α-二羰基形成的影響

肉餅中糖與形成α-二羰基化合物的關(guān)系如圖2。

圖2中表明在烤肉中添加糖（葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜）后有較多數(shù)量和種類的α-二羰基化合物形成。隨著葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜添加量的增多，丙酮醛的量也逐漸的增加；在添加蔗糖量為3 g時(shí)，丙酮醛形成的量最大（圖2a）。對(duì)于乙二醛，隨著各種糖的添加其形成的量較少，在一定程度上其與各種糖的添加量具有一定相關(guān)性（圖2b）。對(duì)于丁二酮，添加蔗糖時(shí)形成丁二酮的水平低于檢測限，葡萄糖和蜂蜜的添加量小于3 g時(shí)，烤肉中也沒有丁二酮形成（圖2c）。當(dāng)葡萄糖添加量為0.75 g時(shí)，3-脫氧葡萄醛酮的形成量已經(jīng)達(dá)到（462.38±14.81）μg/g，顯著高于其它 α-二羰基化合物；但是蔗糖的添加小于或等于1.5 g時(shí)，其沒有3-脫氧葡萄醛酮的形成（圖2d）。葡萄糖醛酮的形成隨著葡萄糖、果糖和蜂蜜的添加量均顯著增多，而在加蔗糖的肉餅中葡萄糖醛酮沒有顯著變化（p＜0.05）（圖2e）。不同糖影響形成α-二羰基化合物產(chǎn)生的趨勢不一樣的主要原因可能是不同種類的糖及其產(chǎn)生的α-二羰基化合物之間的反應(yīng)活性不同造成的。

圖2 不同種類的糖對(duì)α-二羰基形成的影響Fig.2 Relationship between sugars and α-dicarbonyl compounds in oven roasted pork

2.4 烤肉中雜環(huán)胺形成與α-二羰基化合物形成的關(guān)系

以上結(jié)果表明在烤中葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的逐漸加入會(huì)導(dǎo)致PhIP、IQ、MeIQ和MeIQx的形成量降低，而丙酮醛、乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮的形成量均逐漸增加。那么雜環(huán)胺的減少可能與α-二羰基化合物的形成存在一定的關(guān)系。對(duì)添加各種糖時(shí)形成雜環(huán)胺的總量與相應(yīng)的α-二羰基化合物形成總量進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3）。

數(shù)據(jù)顯示兩者之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson's r）分別為-0.952 0，-0.938 6，-0.972 7 和-0.974 9。相關(guān)性結(jié)果分析表明在添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜時(shí)，樣品中α-二羰基化合物的含量與雜環(huán)胺的含量均存在負(fù)相關(guān)性。

圖3 α-二羰基化合物與雜環(huán)胺之間的相關(guān)性Fig.3 Correlations between α-DCs and HAAs

3 結(jié)論與討論

烤肉中，添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜均可顯著抑制雜環(huán)胺（PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx）的生成，且不同種類的糖對(duì)雜環(huán)胺的形成均存在顯著的量效關(guān)系。其中葡萄糖、果糖和蜂蜜對(duì)于各種雜環(huán)胺的抑制效果明顯高于蔗糖。同時(shí)，在烤制過程中添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜，α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮）的產(chǎn)生量顯著增加，且均與糖量呈顯著量效關(guān)系。添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜時(shí)，α-二羰基化合物的形成總量與雜環(huán)胺形成總量之間呈負(fù)相關(guān)性。推測烤肉中糖對(duì)雜環(huán)胺形成的影響與α-二羰基化合物的產(chǎn)生有關(guān)，該結(jié)論與我們報(bào)道的模擬體系的研究結(jié)論一致，即α-二羰基化合物在糖抑制雜環(huán)胺形成中起著重要的作用，本文通過對(duì)實(shí)際樣品中雜環(huán)胺形成和α-二羰基化合物形成的相關(guān)性分析，進(jìn)一步證明糖可能通過熱降解形成的α-二羰基化合物實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中雜環(huán)胺的抑制作用[18]。