豬圓環(huán)病毒3型的快速、可視環(huán)介導(dǎo)等溫檢測(cè)技術(shù)開發(fā)研究

摘譯自Park等. Journal of Virological Methods (2018) 253:26﹣30梁海英，張愛瓊，曾智勇(編譯)

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠(yuǎn)人，博士，貴州大學(xué)教授、碩士研究生導(dǎo)師、貴州大學(xué)學(xué)術(shù)骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫(yī)雜志編委。主要從事動(dòng)物傳染病及病原分子生物學(xué)相關(guān)研究，以規(guī)?；i場(chǎng)主要病毒性疫病為基礎(chǔ)，開展新型疫苗和病原快速檢測(cè)方法及試劑盒的研發(fā)。同時(shí)，長期面向豬場(chǎng)開展豬病毒性疫病的抗體監(jiān)測(cè)和病原的快速檢測(cè)以及規(guī)?；i場(chǎng)疾病防控指導(dǎo)，為豬場(chǎng)提供技術(shù)支持。

主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)，省廳級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng)；參研貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目5項(xiàng)，其他各類省廳(局)級(jí)項(xiàng)目13項(xiàng)；獲“貴州省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)”3項(xiàng)。先后發(fā)表各類學(xué)術(shù)論文180余篇，其中SCI論文3篇，一級(jí)學(xué)報(bào)論文12篇，核心期刊90余篇；參編養(yǎng)殖技術(shù)叢書3冊(cè)，參編專業(yè)類著作2冊(cè)，參編《畜牧獸醫(yī)行政管理學(xué)》（國家規(guī)劃教材）。

圓環(huán)病毒（PCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒。目前報(bào)道的基因型有3種：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1最早于1974年被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是傳代培養(yǎng)細(xì)胞PK-15的永久性污染物，對(duì)豬不具有致病作用，但在很多國家的豬體內(nèi)普遍存在；PCV2則認(rèn)為引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）的主要病原，其中以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為代表，包括母豬繁殖障礙、豬皮炎和腎?。≒DNS）、呼吸系統(tǒng)疾病等；2016年，Plan和Palinski等幾乎同一時(shí)間報(bào)道了一種與豬皮炎和腎病綜合征、生殖功能障礙和多系統(tǒng)炎癥相關(guān)的新型圓環(huán)病毒（PCV3）。隨后，中國、韓國和波蘭在患有呼吸系統(tǒng)疾病、PDNS和生殖系統(tǒng)疾病的豬中也檢測(cè)出了PCV3。這些報(bào)道表明，PCV3在美國，中國，韓國和波蘭的豬群中均有流行。鑒于PCV3的廣泛流行，Park等開發(fā)了一種用于PCV3檢測(cè)的快速、可視環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（LAMP），并用臨床PCV3陽性樣品對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行測(cè)定評(píng)估。

快速、可視環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（LAMP）的開發(fā)是通過使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 4（http：//www．primerexplorer．jp/e/）設(shè)計(jì)靶向PCV3 Cap保守區(qū)域的6個(gè)引物（2個(gè)內(nèi)部，2個(gè)外部和2個(gè)環(huán)狀引物），序列如下：

F3，5'-AAGCAGTGCTCCCCATTG-3'；B3，5'-TGGACCACAAACACTTGGC-3'；FIP，5'-GCTCACCCAGGACAAAGCCTA ACGGTGGGGTCATATGTGT-3'；BIP，5'-TGGTTTGGGGGTGAAGTAACGGC AAGACGACCCTTATGCGGA-3'；LF，5'-TCTCCAGACCCACCCCATG3'；和LB，5'-GAAGTCATAACTTTACGAGTGGAAC-3'。設(shè)計(jì)反應(yīng)體系（25 μ L）如下：20mM T ris-HCl（pH8．8），10 mM KCl，10 mM（NH4）2SO4，0．1% Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，0．12μM羥基萘酚藍(lán)，1．6μM內(nèi)引物（FIP和BIP），0．2μM外引物（F3和B3），0．8μM環(huán)狀引物（LF和LB），1．4 mM dNTP，8mM MgSO4，0．8 mM 甘氨酸三甲胺內(nèi)鹽，5μL模板DNA，最后用dH2O補(bǔ)足25 μL。通過設(shè)計(jì)53 ℃至66 ℃范圍內(nèi)的梯度溫度以及30 min至60 min的反應(yīng)時(shí)間來優(yōu)化反應(yīng)條件，最后以80 ℃ 5 min來終止反應(yīng)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由于存在金屬離子指示劑HNB，可觀察到檢測(cè)反應(yīng)管中從紫色到天藍(lán)色的顏色變化（在LAMP對(duì)陽性核酸擴(kuò)增過程中，產(chǎn)生大量不溶性焦磷酸鎂，導(dǎo)致反應(yīng)溶液中的Mg2+濃度顯著降低，這導(dǎo)致HNB溶液的顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色）。最終通過顏色變化和1．5%瓊脂糖凝膠電泳后條帶效果，確定62°C為最佳反應(yīng)溫度。隨后，在不同反應(yīng)時(shí)間（30～60min），用3種稀釋度的PCV3核酸（5×104，5×103和5×102拷貝/反應(yīng)）進(jìn)行LAMP，確實(shí)最佳反應(yīng)時(shí)間為40 min，在該反應(yīng)時(shí)間完成的擴(kuò)增中，可以觀察到以102個(gè)拷貝為模板的反應(yīng)中有明顯條帶。為測(cè)試LAMP檢測(cè)技術(shù)的特異性，使用PCV1（陽性PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物），PCV2（PCK0201菌株），PCV3，1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV，Lelystad病毒），2型PRRSV（LMY毒株），豬瘟病毒（CSFV，LOM毒株）和豬細(xì)小病毒（PPV，NADL-2毒株）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用未感染PCV3的兩種豬源細(xì)胞培養(yǎng)物（ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞）作為陰性對(duì)照。如預(yù)期的測(cè)定結(jié)果一樣，反應(yīng)終止后在含有PCV3 DNA樣品的反應(yīng)管中觀察到天藍(lán)色，而含有其他病毒、病毒細(xì)胞培養(yǎng)物以及陰性對(duì)照中保持紫色（即沒有顏色變化）。通過凝膠電泳觀察只有含有PCV3 DNA模板的反應(yīng)才能獲得典型的梯狀條帶。這些結(jié)果表明PCV3 LAMP測(cè)定法可以特異性檢測(cè)PCV3，并且不顯示與其他病毒病原體的交叉反應(yīng)性。

圖1 LAMP，PCR和qPCR對(duì)PCV3檢測(cè)的靈敏度比較A：LAMP擴(kuò)增電泳圖；B：LAMP擴(kuò)增可視化；C：PCR擴(kuò)增電泳圖；D：qPCR測(cè)定的擴(kuò)增曲線；編號(hào)1-7：PCV3 擴(kuò)增產(chǎn)物（1-7：5×106-5×100拷貝）；M：100bp梯度Maker NC：陰性對(duì)照

表1 LAMP，PCR和qPCR對(duì)78個(gè)臨床豬樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)比較

Park等使用10倍稀釋法將PCV3標(biāo)準(zhǔn)樣品從 5×106至 5×100拷貝進(jìn)行稀釋，來評(píng)估LAMP測(cè)定的檢測(cè)限（LOD），并與Ku建立的PCR和Palinsk建立的qPCR進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示LAMP測(cè)定的LOD為5×101個(gè) 拷 貝（ 圖1A、1B）， 而PCR和qPCR測(cè)定的LOD分別為5×102個(gè)拷貝（圖1C）和5×101個(gè)拷貝（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，LAMP分析的靈敏度與qPCR相似，比常規(guī)PCR高10倍。

對(duì)于LAMP測(cè)定的臨床評(píng)估，在2017年P(guān)alinski等確定PCV3為陽性的豬場(chǎng)中收集78個(gè)臨床樣品（17個(gè)胎兒組織，29個(gè)消瘦仔豬組織和32個(gè)消瘦仔豬血清樣品），使用LAMP技術(shù)與上述的PCR和qPCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP檢測(cè) PCV3陽性率為 42．3%（33/78），與qPCR相同，并且高于常規(guī)PCR的 26．9%（21/78），見表 1。且通過qPCR檢測(cè)為PCV3陽性的組織和血清樣品經(jīng)LAMP檢測(cè)證實(shí)均為陽性。在特異性、靈敏度和整體一致性方面LAMP測(cè)定結(jié)果與qPCR測(cè)定100%一致（表1）。這些結(jié)果表明LAMP測(cè)定是高度特異和敏感的，并且可以替代常規(guī)PCR和qPCR用于檢測(cè)臨床樣品中的PCV3。

與傳統(tǒng)PCR的測(cè)定相比，Park等建立的PCV3 LAMP檢測(cè)技術(shù)具有快速、可視、高特異性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)，可能將成為臨床樣品中PCV3快速、特異性診斷以及流行病學(xué)調(diào)查的有用工具。