胃癌患者手術(shù)前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化及預(yù)后分析

黨海珍，焦順昌，吳亮亮，姜忠華

T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體免疫監(jiān)視的一道重要防線，無(wú)須預(yù)先抗原激活就具備對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。T細(xì)胞是種類繁多、功能復(fù)雜的一類免疫細(xì)胞。T細(xì)胞的調(diào)節(jié)和活化機(jī)制十分復(fù)雜，是保持免疫狀態(tài)、控制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要一環(huán)。此外，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞均可分泌釋放TNF，后者是局部免疫的重要組成部分，對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散起重要作用。雖然諸多證據(jù)表明，機(jī)體免疫功能的低下可促使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，但也有相反的實(shí)驗(yàn)證據(jù)存在。在一些實(shí)驗(yàn)中有人通過(guò)抑制機(jī)體免疫，發(fā)現(xiàn)無(wú)論對(duì)原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移擴(kuò)散均有促發(fā)效應(yīng)，有可能與免疫逃逸或免疫耐受機(jī)制有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞亞群的分布與年齡、性別、種族等因素相關(guān)［1］。對(duì)不同年齡、性別的健康成年人21項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群之間的差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示， 性別對(duì) CD3－CD16+，CD56+、CD8+CD28+的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［2］，年齡對(duì) CD3+、CD3+CD8+、CD3－CD16+，CD56+、CD8+CD28+、CD4+CD25+的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者通過(guò)檢測(cè)胃癌患者手術(shù)前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化，并與健康人群相對(duì)照，分析其與臨床病理特征及術(shù)后無(wú)病生存期（DFS）的關(guān)系，探討胃癌患者手術(shù)前后T淋巴細(xì)胞亞群在外周血的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，為建立胃癌術(shù)后輔助化療的個(gè)體化模式提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料2010年1月—2011年6月在解放軍總醫(yī)院行手術(shù)治療Ⅰ～Ⅲ期的胃癌病例41例；男34 例，女 7 例；年齡 40～81 歲，平均（59.32±11.41）歲。健康對(duì)照組41例，為中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2009年10月—2010年01月健康體檢的職工；其中男26名，女15名；年齡21～86歲，平均 （43.64±22.08）歲；健康體檢者常規(guī)體檢指標(biāo)正常，均無(wú)腫瘤家族史。

1.2 研究?jī)?nèi)容將所有病例臨床特征如性別、年齡、癥狀、飲酒史、脈管癌栓、腫瘤大體形態(tài)、腫瘤分化、Lauren分型、T分期、N分期、TNM分期列為觀察指標(biāo)，錄入Excel表，并對(duì)收集病例進(jìn)行隨訪，每半年1次統(tǒng)計(jì)隨訪資料，并計(jì)算DFS。

1.3 試驗(yàn)方法患者手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第10天清晨空腹抽取3 ml靜脈血于EDTA－K3抗凝管中，健康體檢者清晨空腹抽取3 ml靜脈血于EDTA－K3抗凝管中，立即送檢。標(biāo)注清楚樣品信息（姓名、性別、年齡、ID號(hào)、細(xì)胞類型、時(shí)間等），樣品在送檢后進(jìn)行處理，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞的濃度至5×105/ml，最后用1×PBS重懸細(xì)胞，用300目的濾網(wǎng)過(guò)濾黏連細(xì)胞；加入檢測(cè)抗體及同型對(duì)照抗體，分為兩種檢測(cè)組合抗體， 分別為：CD4－FITC、CD8－PE、CD3－PC5；CD16－FITC、CD56－PE、CD3－PC5，加入檢測(cè)抗體后，分別在另外的試管中加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體 （檢測(cè)抗體和同型對(duì)照抗體的量按照抗體說(shuō)明書），手持試管輕輕搖勻，室溫（16～22 ℃），避光放置20～30 min。 依次向各試管中加入 1 ml 1×PBS，1200R，10 min，棄上清。 加入 500 μl 1×PBS 漩渦震蕩5～10 s，待上機(jī)檢測(cè)。試劑：同型對(duì)照抗體及測(cè)定抗體均為貝克曼庫(kù)爾特公司；儀器：流式細(xì)胞儀等。

1.4 檢測(cè)及結(jié)果分析熒光校準(zhǔn)微球：Flow－Check TM Fluorospheres校正儀器，HPCV值＜3%確保機(jī)器狀態(tài)良好；在流式細(xì)胞儀MXP分析軟件上打開淋巴細(xì)胞亞群，檢測(cè)方案嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行：實(shí)驗(yàn)完成后檢驗(yàn)樣品中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+（NKT）、CD3 －CD16+CD56+（NK），統(tǒng)計(jì)各亞群百分比數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件包，對(duì)兩個(gè)或多個(gè)變量元素選用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析，對(duì)某一變量的分析選擇Log-rank檢驗(yàn)，多因素指數(shù)體系選擇COX回歸，無(wú)病生存期以（±s）表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床及病理特點(diǎn)外科手術(shù)方式包括腹腔鏡輔助胃癌根治術(shù)備全胃切除術(shù)32例（78.05%），胃癌根治+化療泵置入術(shù)9例（21.95%）；病理類型包括低分化腺癌12例（29.27%），中分化腺癌6例（14.63%），高分化腺癌 12 例（29.27%），印戒細(xì)胞癌3例（7.32%），黏液腺癌 5例（12.20%），管狀腺癌 1例（2.44%），乳頭狀腺癌 1例（2.44%），低分化癌肉瘤 1例 （2.44%）；分化程度包括低分化 13例（31.71%）， 中分化 6例 （14.63%）， 高分化 12例（29.27%），以及印戒細(xì)胞癌及黏液腺癌等未能判斷分化程度者10例（24.39%）。

T分期包括T1a期3例 （7.32%），T1b期 2例（4.88%），T2期 2例（4.88%），T3期 7例（17.07%），T4a期 13例（31.71%），T4b期 14例（34.15%）；N 分期包括N0期13例（31.71%），N1期7例（17.07%），N2期 7例（17.07%），N3a期 6例（14.63%），N3b期8例（19.51%）；臨床分期ⅠA 期 5例（12.20%），ⅡA期 1例（2.44%），ⅡB 期 3例（7.32%），ⅢA 期 7例（17.1%）， ⅢB期 14例 （34.15%）， ⅢC期 11例（26.83%）。

2.2 臨床病理與預(yù)后相關(guān)性對(duì)41例胃癌術(shù)后患者進(jìn)行臨床病理特點(diǎn)與預(yù)后（DFS）相關(guān)的單因素分析，年齡、癥狀、TNM分期、手術(shù)切緣與DFS相關(guān)。年齡＜60歲與≥60歲患者中位DFS分別為18和15個(gè)月，DFS生存率分別為81.82%與68.18%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；確診時(shí)有癥狀和無(wú)癥狀者中位DFS分別為17個(gè)月和22個(gè)月，DFS生存率分別為77.27%與100%（P＜0.05）；TNM分期Ⅰ期/Ⅱ期、Ⅲ期中位DFS分別22和16個(gè)月，DFS生存率分別為100%與72.73%（P＜0.01）；患者手術(shù)切緣陰性與陽(yáng)性中位DFS為17和5個(gè)月，DFS生存率分別為77.27%與12.20%（P＜0.05）。其他如性別、飲酒史、Lauren分型、脈管癌栓、癌細(xì)胞分化、合并慢性病、大體形態(tài)、術(shù)式、混合病理類型、放療等因素對(duì)DFS的影響均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 手術(shù)前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化外周血T細(xì)胞CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組分別與健康對(duì)照組、胃癌術(shù)后組相比明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，P＜0.01）；CD3+CD8+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組分別與健康對(duì)照組、胃癌術(shù)后組比較增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，P＜0.01）；CD8+CD28+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組與健康對(duì)照組比較降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+CD25+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組、術(shù)后組分別與健康對(duì)照組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

2.4 T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)對(duì)預(yù)后影響的分析筆者以健康對(duì)照組數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)與預(yù)后（DFS）進(jìn)行單因素分析，僅胃癌患者術(shù)后第10天外周血CD3+CD4+的表達(dá)與DFS相關(guān)。如表3所示，術(shù)后第10天CD3+CD4+低表達(dá)與高表達(dá)中位DFS分別為16個(gè)月和18個(gè)月（圖1）， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）； 術(shù)前CD3+CD4+低表達(dá)與高表達(dá)中位DFS分別為16個(gè)月和22個(gè)月，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余各項(xiàng)指標(biāo)與DFS的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表 1 41例胃癌術(shù)后患者臨床病理特點(diǎn)與DFS的單因素分析

2.5 T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)DFS影響的COX生存分析選擇胃癌患者手術(shù)前后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28－、CD4+CD25+、CD3－CD16+，CD56+、CD3+CD16+，CD56+等因素進(jìn)行COX回歸分析。結(jié)果顯示，在該組病例中，胃癌患者術(shù)后CD3+、CD3+CD8+和CD3－CD16+，CD56+的表達(dá)是DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。如表4所示，胃癌患者術(shù)后外周血CD3+、CD3－CD16+，CD56+低表達(dá)較高表達(dá)，CD3+CD8+高表達(dá)較低表達(dá)，疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分別為0.273、2.595、5.394倍。見表4。

表 2 胃癌患者手術(shù)前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)（±s，%）

表 2 胃癌患者手術(shù)前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)（±s，%）

注：胃癌術(shù)前組與健康對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；胃癌術(shù)后組與健康對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；胃癌術(shù)后組與術(shù)前組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+/CD8+ CD8+CD28+ CD8+CD28－ CD4+CD25+ CD3－CD16+56+健康對(duì)照組 69.11±9.25 39.10±7.12 25.69±7.84 1.72±0.74 16.35±5.20 14.50±6.66 7.47±2.98 12.41±7.93胃癌術(shù)前組 64.32±10.12＊ 33.29±7.56＊＊ 29.12±7.46＊ 1.26±0.51＊＊ 13.75±5.29＊ 17.19±7.53 9.32±3.02＊＊ 10.15±7.92胃癌術(shù)后組 68.22±7.57△ 37.59±9.56△ 25.26±6.05△△ 1.62±0.72△△ 15.12±4.52 16.16±7.09 9.69±3.58▲▲ 12.82±6.00

表 3 T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)與DFS的關(guān)系（±s）

表 3 T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)與DFS的關(guān)系（±s）

T淋巴細(xì)胞亞群（%） 術(shù)前DFS（月） P值 術(shù)后DFS（月） P值CD3+ 0.087 0.143＜69.11 16.00±0.57 16.00±0.61≥69.11 19.00±0.57 18.00±0.89 CD3+CD4+ 0.073 0.032＜39.10 16.00±0.60 16.00±0.42≥39.10 22.00±0.00 18.00±0.67 CD3+CD8+ 0.210 0.133＜25.69 20.00±3.06 19.00±1.93≥25.69 17.00±0.57 16.00±0.71 CD4+/CD8+ 0.439 0.370＜1.72 17.00±0.99 16.00±0.86≥1.72 15.00±5.99 17.00±0.73 CD8+CD28+ 0.974 0.399＜16.35 17.00±1.00 17.00±1.71≥16.35 15.00±1.77 18.00±1.07 CD8+CD28－ 0.536 0.228＜14.50 17.00±1.58 18.00±1.12≥14.50 17.00±1.15 16.00±0.41 CD4+CD25+ 0.301 0.725＜7.47 19.00±1.26 18.00±1.41≥7.47 16.00±0.62 16.00±0.86 CD3－CD16+，CD56+ 0.885 0.268＜12.41 17.00±0.58 19.00±0.30≥12.41 18.00±2.69 16.00±0.48 CD3+CD16+，CD56+ 0.749 0.075＜8.51 17.00±0.86 18.00±0.79≥8.51 19.00±0.00 16.00±0.61

圖 1 術(shù)后第10天CD3+CD4+表達(dá)與DFS關(guān)系

表 4 術(shù)后T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)DFS影響的COX生存分析

3 討論

研究資料表明，胃癌發(fā)病率及死亡率與性別、地域有相關(guān)性。納入研究的41例胃癌病例，其中男34例（82.9%），女 7例（17.1%）；中位年齡為 59歲（40～81 歲）；有飲酒史 12 例（29.3%）；有腫瘤家族史10例（24.4%）；治療前有其他伴隨疾病者25例（60.9%）；確診前有明確癥狀者37例（90.2%），常見癥狀依次為：上腹部不適（疼痛、脹悶）、進(jìn)食時(shí)哽噎感、便血、嘔血、乏力等。此次入組病例各臨床特征分布較均勻，全部病例隨訪時(shí)間為10～256個(gè)月，中位隨訪期為65個(gè)月，截至該研究隨訪終點(diǎn)2017年6月30日，出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者27例，其中6例（14.63%）死亡，1例失訪，均未達(dá)到中位生存期，1年、2年和3年的總生存率分別為95.12%、90.24%和82.93%；有1例死于骨髓抑制引起的肺部感染，2例死于繼發(fā)的肝轉(zhuǎn)移癌，3例死亡原因不詳，14例截至隨訪終點(diǎn)未監(jiān)測(cè)到腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，中位DFS為 17個(gè)月，平均（17.00±0.77）個(gè)月，1年無(wú)病生存期（DFS）生存率為70.6%。由于該研究對(duì)象為能手術(shù)切除腫瘤的Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者，所以選擇能準(zhǔn)確反映術(shù)后輔助治療的DFS作為主要觀察指標(biāo)。

對(duì)41例胃癌術(shù)后臨床病理特點(diǎn)與預(yù)后（DFS）相關(guān)性的單因素分析結(jié)果顯示：年齡、癥狀、TNM分期、手術(shù)切緣與DFS相關(guān)。其他如性別、飲酒史、Lauren分型、脈管癌栓、癌細(xì)胞分化、合并慢性病、大體形態(tài)、術(shù)式、混合病理類型等因素對(duì)DFS的影響均無(wú)顯著性差異。有研究顯示淋巴細(xì)胞亞群的分布與年齡、性別、種族等因素相關(guān)［1］，還有研究發(fā)現(xiàn)［3］胃癌患者外周血CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+細(xì)胞比值均明顯低于正常人，而CD8+細(xì)胞則明顯高于正常人。該研究發(fā)現(xiàn)外周血T細(xì)胞CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組低于健康對(duì)照組、胃癌術(shù)后組（P＜0.05，P＜0.01）；CD3+CD8+的表達(dá)，胃癌術(shù)前組高于健康對(duì)照組、胃癌術(shù)后組（P＜0.05，P＜0.01）；研究結(jié)果提示胃癌患者均存在免疫功能紊亂，與既往研究結(jié)果相一致［4－6］。 該研究結(jié)果顯示胃癌術(shù)后與術(shù)前相比，患者外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平有所升高，CD3+CD8+表達(dá)下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；而胃癌術(shù)后組與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果提示手術(shù)切除腫瘤對(duì)宿主免疫抑制的恢復(fù)有所幫助。有研究證實(shí)胃癌的進(jìn)展與 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)減弱相關(guān)［7，8］，該研究顯示胃癌術(shù)前患者 CD3+CD8+水平增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9－12］。

胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中，淋巴細(xì)胞的免疫功能是構(gòu)成機(jī)體免疫防御功能的重要因素。該研究結(jié)果顯示，胃癌術(shù)前組外周血T細(xì)胞CD8+CD28+的表達(dá)低于健康對(duì)照組（P＜0.05），CD8+CD28－的表達(dá)高于健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究結(jié)果顯示胃癌患者CD8+CD28+低于正常組，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［13，14］。 CD8+CD28－的表達(dá)雖然較健康對(duì)照組增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析可能樣本數(shù)較少，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。該研究顯示外周血T細(xì)胞CD8+CD28+的表達(dá)，胃癌術(shù)后組高于胃癌術(shù)前組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。胃癌術(shù)前組患者外周血CD8+CD28+T細(xì)胞明顯降低，提示胃癌患者宿主免疫功能處于抑制狀態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。該研究證實(shí)機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系。腫瘤免疫學(xué)研究顯示患者預(yù)后可能與免疫狀態(tài)有關(guān)，該研究結(jié)果提示增強(qiáng)免疫力可能會(huì)達(dá)到抗腫瘤的目的。

由于該研究對(duì)象為能手術(shù)切除的Ⅰ～Ⅲ期胃癌，較OS相比，DFS更能準(zhǔn)確反映術(shù)后輔助治療的療效，因此在該研究中，以健康對(duì)照組數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)與預(yù)后（DFS）進(jìn)行單因素分析，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者術(shù)后第10天外周血CD3+CD4+的表達(dá)與DFS相關(guān)，胃癌患者術(shù)后第10天CD3+CD4+低表達(dá)與高表達(dá)中位DFS分別為16個(gè)月和18個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而胃癌患者術(shù)前CD3+CD4+低表達(dá)與高表達(dá)中位DFS分別為16和22個(gè)月，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。研究結(jié)果提示胃癌患者術(shù)后CD3+CD4+細(xì)胞表達(dá)正常腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)降低。選擇胃癌患者手術(shù)前后T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28－、CD4+CD25+、CD3－CD16+，CD56+、CD3+CD16+，CD56+等因素進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示，在該組病例中，胃癌患者術(shù)后CD3+、CD3+CD8+和CD3－CD16+，CD56+的表達(dá)是DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，胃癌患者術(shù)后外周血CD3+低表達(dá)疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是高表達(dá)的27.3%，而CD3－CD16+，CD56+低表達(dá)較高表達(dá)、CD3+CD8+高表達(dá)較低表達(dá)疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分別為2.595、5.394倍。研究結(jié)果顯示胃癌生存時(shí)間與機(jī)體免疫功能紊亂和低下密切相關(guān)。因此，在胃癌患者治療過(guò)程中，定期對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的評(píng)價(jià)及調(diào)整可能為腫瘤的治療提供新的思路，通過(guò)腫瘤患者T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，進(jìn)一步加大樣本量的研究，可能為抗腫瘤治療提供新的依據(jù)及途徑。