改進(jìn)的CTAB法提取32種中藥破壁飲片DNA及物種鑒定

王 艷 成金樂(lè)

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心、嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)）、國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437）

中藥破壁飲片[1]是中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司研發(fā)的一種創(chuàng)新型中藥飲片，系指將符合法定標(biāo)準(zhǔn)要求并具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物類中藥飲片，經(jīng)現(xiàn)代粉碎技術(shù)加工至D90＜45 μm（300目以上） 的粉體，不添加成型劑制成30～100目的具有原飲片全成分的均勻干燥顆粒狀飲片。中藥破壁飲片在保證物質(zhì)基礎(chǔ)沒(méi)有改變的前提下，將物質(zhì)成分利用率提高至90%以上，是傳統(tǒng)飲片煎煮提取的3倍以上，從而大幅度減少使用劑量。這對(duì)于資源緊缺的中藥，尤其是貴重藥材的可持續(xù)利用具有重大的意義。為了保證臨床及日常使用的安全有效，中藥破壁飲片的真?zhèn)舞b別及其重要前提。然而破壁飲片經(jīng)過(guò)破壁粉碎處理后，其粉體粒度非常小，失去了傳統(tǒng)中藥飲片應(yīng)有的性狀特征和絕大部分的顯微特征。利用傳統(tǒng)飲片法定標(biāo)準(zhǔn)中的性狀鑒別和粉末鑒別法來(lái)鑒定中藥破壁飲片真實(shí)性的可行性比較低。因此，建立一種行之有效、可信可靠的方法來(lái)鑒定中藥破壁飲片的真實(shí)性是非常有必要的。

DNA條形碼是近年來(lái)發(fā)展迅速的可用于動(dòng)植物物種快速鑒定的技術(shù)[2]，是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)，是近年來(lái)生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)。DNA條形碼直接利用物種的遺傳信息在分子水平上進(jìn)行鑒別，為物種鑒定提供了最本質(zhì)的依據(jù)。DNA條形碼作為新的分子鑒定技術(shù)，在物種鑒定方面有著其他技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)：①技術(shù)指標(biāo)相對(duì)統(tǒng)一：只需選用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)合適的基因片段即可對(duì)整個(gè)屬、科甚至幾十個(gè)科的絕大部分物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定；②快速高效；③重復(fù)性和穩(wěn)定性好；④試驗(yàn)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化、簡(jiǎn)單化；⑤鑒定信息的可管理性：試驗(yàn)所得的物種序列信息可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)和信息平臺(tái)等在全球范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一管理和資源共享，有利于構(gòu)建系統(tǒng)、完整的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。

與傳統(tǒng)鑒定方法相比，DNA條形碼技術(shù)可快速有效地達(dá)到物種鑒定的目的，并且不受個(gè)體形態(tài)、大小、發(fā)育生長(zhǎng)階段和完整性的影響。DNA條形碼是近年來(lái)發(fā)展迅速的可用于動(dòng)植物物種快速鑒定的技術(shù)，因此也被廣泛用于藥用植物的物種鑒定工作中。陳士林等[2]應(yīng)用ITS2、psbA-trnH和COI序列完成了《中華人民共和國(guó)藥典》2010版208味中藥材原動(dòng)植物及1000余種混淆品種的DNA條形碼鑒定。同時(shí)該課題組對(duì)6000余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA條形碼序列篩選，提出以ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[3]，以psbA-trnH作為輔助的藥用植物鑒定技術(shù)的思路[4]。馬新業(yè)等[5]研究發(fā)現(xiàn)psbA-trnH在藥用蕨類中具有較高的PCR擴(kuò)增率和物種鑒定率，并建議psbA-trnH作為蕨類中藥的DNA條形碼序列。朱英杰等[6]對(duì)重樓屬11個(gè)物種17份樣品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ITS2序列在重樓屬中的鑒定成功率達(dá)到100%。

中藥破壁飲片是一類創(chuàng)新型中藥飲片，經(jīng)過(guò)破壁處理后已完全失去外觀形狀，無(wú)法進(jìn)行傳統(tǒng)的性狀鑒別。同時(shí)，由于破壁粉末粒徑極小，顯微特征也大多缺失。因此，傳統(tǒng)鑒定方法已不能適用于破壁飲片的鑒別，而DNA條形碼正好提供了一個(gè)強(qiáng)大的鑒別手段?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》 （2010年版第三增補(bǔ)版）收錄了DNA條形碼技術(shù)，作為中藥材質(zhì)量控制的新方法[7]。近幾年來(lái)，相關(guān)課題組成員已針對(duì)中藥破壁飲片的DNA條形碼鑒別展開(kāi)了一系列的科研實(shí)驗(yàn)，并且已經(jīng)利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本[8]。向麗等[9]選用ITS2序列作為DNA條形碼對(duì)全草類、根及根莖類、葉類、花類、果實(shí)類和種子類的31種代表性中藥（28個(gè)物種）的原藥材、超微飲片及破壁飲片共93份樣品進(jìn)行研究，驗(yàn)證DNA條形碼技術(shù)對(duì)中藥超微飲片和中藥破壁飲片基原物種追溯的可靠性。DNA條形碼技術(shù)近年來(lái)在中藥的鑒定應(yīng)用方面的推廣，為破壁飲片等粉末或顆粒狀中藥制品的物種鑒定提供了很好的技術(shù)參考。DNA條形碼在破壁飲片的物種鑒定的成功應(yīng)用，也對(duì)后者的質(zhì)量控制發(fā)揮了重要的作用。而對(duì)于DNA提取的方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究也有很多種，如氯化銫法、SDS法和一管法等[10]，并把它運(yùn)用在動(dòng)、植物和微生物的DNA研究中。由于這些DNA提取方法有的成本高和使用會(huì)造成環(huán)境污染，且提取效果不夠理想。隨著這一技術(shù)逐步改進(jìn)，如Saghai-Maroof等[11]研發(fā)出十六烷基三甲基溴化銨 （CTAB）法用于提取植物DNA等，使得DNA的提取相對(duì)較為快捷，提取的DNA質(zhì)量較高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的CTAB法提取32個(gè)中藥破壁飲片品種的DNA，以ITS2為鑒定序列，其方法簡(jiǎn)單可行，能高效達(dá)到提取樣品中的DNA并測(cè)序成功及物種鑒定。

1 基本原理

利用CTAB在高離子強(qiáng)度的緩沖溶液中與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，但不沉淀核酸的特性，用離心獲得含DNA的上清液；用氯仿和異戊醇混合液使蛋白質(zhì)變性、分層，同時(shí)除去脂類的方法，從而達(dá)到提取和純化DNA的目的。

2 材料及儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 白芍（批號(hào)：20141205）、大棗（批號(hào)：20141208）、槐花（批號(hào)：20140722）、荷葉（批號(hào)：20140901）、雞骨草（批號(hào)：20141216）、木棉花（批號(hào)：20141231）、人參 （批號(hào)：20141221）、熟三七（批號(hào)：20141202）、山銀花（批號(hào)：20141214）、太子參（批號(hào)：20141207）、鹽補(bǔ)骨脂（批號(hào)：20141203）、薏苡仁（批號(hào)：20140729）、枳實(shí)（批號(hào)：20140326）、木瓜（批號(hào)：20141205）、百合（批號(hào)：20140805）、葛花（批號(hào)：20140715）、蓮子、（批號(hào)：20140729）、白術(shù)（批號(hào)：201709P001）、白芷（批號(hào)：20170502）、川芎（批號(hào)：20171201）、桔梗（批號(hào)：20170701）、女貞子 （批號(hào)：20170602）、肉蓯蓉 （批號(hào)：20170801）、玄參（批號(hào)：20170701）、白茅根（批號(hào)：170801）、炒麥芽（批號(hào)）、佛手（批號(hào)：170901）、柯子（批號(hào)：C-170157）、南沙參（批號(hào)：B705101-01）、桑葚（批號(hào)：171001）、冬凌草（批號(hào)：A170601）、五指毛桃（批號(hào)：170102）

2.2 試劑 主要有NaCl、EDTA、Tris、HCl、CTAB、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、PVP-40等。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物樣品均質(zhì)儀（愛(ài)施德，Bioprep-24）、低 溫冰 箱 （Eppendorf，5430R）； 多 功能PCR儀（Biometra，F(xiàn)lex Cycler 2）；水平電泳儀 （Bio-Rad）；凝膠成像儀（Biometra，BDA digital）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 CTAB溶液的配制 CTAB緩沖液配制如表1。

表1 3%CTAB（1000 mL）緩沖液配制成分表

3.2 DNA提取 取已研磨好的樣品50 mg，向各樣品管中加入800 μL核分離液 （100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，0.7 mol/L NaCl，20 g PVP-40，2 mLβ-巰基乙醇）劇烈振蕩，旋轉(zhuǎn)混勻5 min，12000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟1～2次；向各樣品管中加入800 μL 3%CTAB緩沖液，充分振蕩混勻，65℃金屬浴中孵育3 h，期間每隔10 min左右顛倒混勻數(shù)下。加入600 μL氯仿-異戊醇 （24∶1，V∶V），充分振蕩混勻，12000 r/min離心10 min，小心吸取上清于新的1.5 mL離心管中。加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，分次轉(zhuǎn)移至吸附柱中12 000 r/min離心1 min，棄去下液。加入700 μL-4℃預(yù)冷的75%乙醇，12000 r/min離心1 min，棄盡下液，繼續(xù)加入500 μL-4℃預(yù)冷的75%乙醇，上下顛倒混勻數(shù)次，12000 r/min離心1 min，棄盡下液，將空管離心1 min，取出加入50 μL 65℃預(yù)熱的dd H2O，12000 r/min離心1 min，置于-20℃保存，備用。

表2 ITS2比對(duì)結(jié)果

3.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR反應(yīng)體系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5 μL，正反向引物：ITS2-2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-3R，GACGCTTCTCCAGACTACAAT各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至25.0 μL；陰性對(duì)照 （Negative control，NC） 采用ddH2O作為模板。溫度程序（ITS2）：94℃，4 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。反應(yīng)完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各PCR產(chǎn)物，在目的區(qū)域出現(xiàn)清晰條帶的樣品則送檢做Sanger測(cè)序[12]。

3.4 數(shù)據(jù)處理 將測(cè)序所得的原始峰圖導(dǎo)入Codon-CodeAligner（Version 5.1.5.0） 進(jìn)行序列處理，去除5.8SrRNA和28SrRNA區(qū)以獲得ITS2序列。將各樣品的ITS2序列作為Quary分別在NCBI、中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174）上做比對(duì)，取同源性最高的比對(duì)結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用ITS2片段可以成功鑒定出本研究中的32個(gè)中藥破壁飲片品種，各樣品的ITS2序列比對(duì)結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列的同源性達(dá)到95%以上。結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

中藥破壁飲片通過(guò)氣流破壁技術(shù)導(dǎo)致其形態(tài)及外觀特征發(fā)生改變，難以對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。本文運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)32個(gè)中藥破壁飲片品種進(jìn)行物種鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明改良的CTAB法對(duì)于一些炮制過(guò)的樣品也能成功地提取出DNA，同時(shí)也說(shuō)明破壁技術(shù)未對(duì)藥材的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生破壞。在實(shí)驗(yàn)研究初期，也嘗試使用試劑盒法提取DNA，結(jié)果都不理想，而采用改良的CTAB法能達(dá)到提取及鑒定的效果。用3%CTAB進(jìn)行提取，比常規(guī)的CTAB法提取出來(lái)的DNA更純，由于植物組織，如葉片中含有較高的多酚、蛋白質(zhì)、脂類、多酯的角質(zhì)等不利于DNA提取過(guò)程中干擾物質(zhì)的去除，利用常規(guī)的CTAB方法等難以獲得高質(zhì)量DNA。主要原因是提取所得的DNA樣品中含有較高含量的蛋白質(zhì)，甚至具有多酚氧化的褐色物等，從而影響利用DNA進(jìn)行進(jìn)一步的特性分析（如酶切，PCR反應(yīng)等）。運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)中藥破壁飲片進(jìn)行鑒定可以不受藥材外部形態(tài)不完整或已被加工成粉末、飲片的影響，能直接在分子水平上對(duì)中藥材進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，為中藥破壁飲片的真?zhèn)舞b別提供有效手段。