離體培養(yǎng)中利用病菌粗毒素檢測香蕉枯萎病抗性研究

羅燕羽，劉紹欽，黃紹力，劉偉光，張木清，黃熾輝

（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510308）

香蕉（Musa spp.）是我國華南地區(qū)四大佳果之一，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果。香蕉枯萎?。˙anana Fusarium wilt）又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense，F(xiàn)OC）侵染而引起維管束壞死的一種毀滅性真菌病害和典型的土傳病害［1-2］。尖孢鐮刀菌以菌絲體、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附著于根系表皮細(xì)胞，通過分泌一系列毒素破壞根系的膜結(jié)構(gòu)，造成植株代謝紊亂，感染后期可直接侵染植株維管束，導(dǎo)致維管束木質(zhì)化［3］。該病最早于1874年在澳大利亞被發(fā)現(xiàn)，1890年開始在中美洲發(fā)生流行，20世紀(jì)60年代在我國也開始發(fā)生［4］，近幾年，香蕉枯萎病依然在蔓延，且已導(dǎo)致多個(gè)主產(chǎn)區(qū)的香蕉種植面積迅速下降，嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［5］。尖孢鐮刀菌古巴專化型共有4個(gè)生理小種，為害廣東、廣西、福建、海南、云南局部地區(qū)的主要為1號(hào)生理小種和4號(hào)生理小種，其中4號(hào)生理小種的危害性最大、分布最廣，其寄主范圍及為害程度均大于其他小種［6］。

目前控制香蕉枯萎病的主要手段還是化學(xué)防治、生物防治、輪作與套種及綜合防控。柳紅娟等［7］認(rèn)為木薯塊根的浸提液對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌有一定抑制效果，可通過木薯與香蕉間套種或木薯與香蕉輪作等栽培模式，起到抑制香蕉病害發(fā)生的作用；陳遠(yuǎn)鳳等［8］研究發(fā)現(xiàn)，使用濃度高于5 mg/L的ClO2進(jìn)行水體消毒可有效預(yù)防枯萎病和軟腐病通過水源傳播，用濃度為1 500 mg/L的ClO2可清除發(fā)病蕉穴土壤中的病原；劉衛(wèi)軍［9］使用生防制劑可顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，且還能增加土壤微生物多樣性指數(shù)。雖然化學(xué)防治、生物防治、輪作與套種等手段在一定程度上可以控制香蕉枯萎病的蔓延，但是要想從根本上解決問題，培育出抗枯萎病的香蕉品種是最好的防治措施［10-12］。近年來，選育抗（耐）枯萎病的主要手段是在離體條件下，利用化學(xué)誘變劑、枯萎病菌培養(yǎng)濾液或毒素等化學(xué)或生物誘變來篩選抗病突變體［6］，且其獲得抗病突變體效率高、操作程序簡單，已成為目前快速選育香蕉抗病品種的重要手段。Matsumoto等［13］最先研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加粗毒素篩選出的耐毒素突變體可明顯提高對(duì)香蕉枯萎病的抗病性。韋紹龍等［14］利用組織培養(yǎng)芽變和接種病菌壓力選擇的方法也選育出抗（耐）香蕉枯萎病品種——桂蕉9號(hào)。據(jù)報(bào)道，目前抗（耐）枯萎病香蕉品種主要有抗枯5號(hào)、農(nóng)科1號(hào)、桂蕉9號(hào)、寶島蕉、金手指等，但是關(guān)于這些抗病品種的抗性機(jī)理還不是很清楚［15］。

雖然關(guān)于在離體條件下，利用香蕉枯萎病菌粗毒素來篩選抗病突變體是獲得抗（耐）毒素的報(bào)道已有頗多，但是在生產(chǎn)應(yīng)用上還尚未有通過該方法獲得的抗枯萎病香蕉品種。本研究結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，利用香蕉枯萎病菌粗毒素對(duì)巴西蕉、農(nóng)科1號(hào)、粉雜1號(hào)、粉蕉和東莞大蕉5個(gè)不同枯萎病抗性品種香蕉的離體培養(yǎng)芽進(jìn)行處理，研究品種抗性與粗毒素的相關(guān)關(guān)系，以期得出在離體培養(yǎng)早期鑒定品種抗性的可行性；利用香蕉病粗毒素對(duì)兩個(gè)香蕉品種進(jìn)行選擇性誘變，以期篩選出抗（耐）枯萎病的新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為巴西蕉、農(nóng)科1號(hào)、粉雜1號(hào)、粉蕉、東莞大蕉吸芽所誘導(dǎo)的增殖芽第5代，巴西蕉、農(nóng)科1號(hào)薄片培養(yǎng)的不定芽，以上材料均來自廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

供試菌株為香蕉枯萎病菌——尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種，來自廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。供試藥品鐮刀菌酸（Fusaric acid，F(xiàn)A）購自Sigma公司。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，去離子水定容至1 000 mL；大米培養(yǎng)基：50 g大米，60 mL混合液（含0.5%土壤浸出液+0.2%ZnSO4溶液），過夜培養(yǎng)浸泡后，過濾，稱取50 g大米于250 mL三角瓶中，加入60 mL稀釋后的濾液（蒸餾水∶濾液=9∶1），密封后121℃滅菌30 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗毒素制備 香蕉枯萎病菌粗毒素的制備參考陳石［16］和武玉卓等［17］的方法略有改動(dòng)。具體操作方法如下：（1）將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上生長7 d后，用無菌水制成106個(gè)/mL的孢子懸浮液；（2）孢子懸浮液按5%的接種量接種于大米培養(yǎng)基上，充分混勻后，于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，期間每天搖動(dòng)培養(yǎng)基，以使培養(yǎng)基充分疏散，防止菌絲結(jié)塊；（3）培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物85℃滅菌30 min，以殺死菌絲和孢子；（4）將滅菌后的培養(yǎng)物用乙酸乙酯浸泡2 h，過濾出菌絲和培養(yǎng)物，收集乙酸乙酯相，50℃減壓濃縮至干，即得毒素結(jié)晶；（5）用少量95%乙醇溶解結(jié)晶并用蒸餾水定容至10 mL，即得粗毒素溶液，無菌過濾，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 FA含量測定 以FA為標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分光光度計(jì)測定不同濃度（5、10、15、20、25 mg/L）下標(biāo)準(zhǔn)FA的紫外吸收?qǐng)D譜及吸光度（OD269），以光密度為縱坐標(biāo)、FA濃度為橫坐標(biāo)繪制FA標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，將粗毒素液用蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度，在紫外分光光度計(jì)上計(jì)算濾液中FA的含量（mg/L），公式如下：

試樣FA含量=試樣OD值×標(biāo)樣FA含量/標(biāo)樣OD值

1.2.3 不同品種香蕉對(duì)FA的敏感性測定 將所提取的粗毒素加入到香蕉吸芽所誘導(dǎo)的組培苗增殖芽培養(yǎng)基中，配置成FA濃度為15、35、55、75 mg/L的培養(yǎng)基，將香蕉組培苗接入含毒素的培養(yǎng)基，每瓶接7株（芽），每個(gè)處理6瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)不同品種香蕉組培苗增殖芽的存活率，公式如下：

不同品種香蕉對(duì)FA的敏感性以芽的存活率來計(jì)算，芽的存活率越高，敏感性越差。

1.2.4 抗性目標(biāo)芽的離體篩選 （1）香蕉薄片培養(yǎng)。將香蕉的組培苗去掉假莖外部的葉片，從莖段基部第1條根部位起，向上1.5 cm作為切取薄片的部位，從下向上依次切取0.3～0.5 mm厚的薄片接種于香蕉薄片培養(yǎng)基中，香蕉薄片培養(yǎng)基為MS+6-BA 4 mg/L+IAA 0.2 mg/L，培養(yǎng)出不定芽后加代繁殖備用。

（2）半致死FA濃度的測定。半致死FA濃度的測定參考張?。?］和劉海瑞等［18］的方法進(jìn)行設(shè)定，具體如下：以巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)薄片誘導(dǎo)的不定芽為材料，將其接入到含F(xiàn)A濃度為15、35、55、75 mg/L的培養(yǎng)基中，每瓶接7株，每個(gè)處理6瓶，3次重復(fù)，以不含毒素的培養(yǎng)基為對(duì)照組。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)成芽率，初步確定出半致死劑量。

（3）目標(biāo)芽的篩選。以巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)通過薄片培養(yǎng)獲得的不定芽為材料，按如下步驟進(jìn)行粗毒素壓力篩選：半致死濃度轉(zhuǎn)接至芽存活趨于穩(wěn)定——高濃度（半致死濃度加倍）轉(zhuǎn)接至芽存活趨于穩(wěn)定——空白——半致死濃度，以不含粗毒素培養(yǎng)為空白對(duì)照，每瓶接7株，每個(gè)處理6瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)組培苗增殖芽的存活率。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Ducan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毒素中FA含量的測定

根據(jù)5種含不同劑量FA標(biāo)樣溶液在269 nm處所測得的OD值結(jié)果，制成FA含量和OD269的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其線性方程為：Y=0.047X-0.038（R2=0.996）。在相同條件下測出粗毒素試樣的OD269，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后得出供試樣品的FA含量為325.2 mg/L。

圖1 FA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同品種香蕉組培增殖芽對(duì)FA的敏感性測定

在生產(chǎn)實(shí)踐中，已知5個(gè)品種香蕉對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種抗性程度由強(qiáng)至弱表現(xiàn)為東莞大蕉＞粉雜1號(hào)＞農(nóng)科1號(hào)＞巴西蕉＞粉蕉［19］。5個(gè)品種組培苗增殖芽在含不同劑量粗毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，增殖芽的存活率隨著FA濃度的提高而下降，但不同品種對(duì)FA濃度的敏感性存在較大差異（表1、圖2，封二）。由表1可知，5個(gè)品種的香蕉離體培養(yǎng)芽對(duì)粗毒素的敏感性程度表現(xiàn)為農(nóng)科1號(hào)＞粉蕉＞粉雜＞巴西蕉＞東莞大蕉。比較品種抗性和離體增殖芽敏感性測定發(fā)現(xiàn)，品種的抗病性與對(duì)粗毒素的敏感性并沒有相關(guān)關(guān)系，對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種抗性強(qiáng)的香蕉品種，經(jīng)粗毒素處理后存活率不一定就高，可見，通過組培苗增殖芽對(duì)粗毒素的敏感性測定并不能判斷一個(gè)香蕉品種對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種抗性的強(qiáng)弱。

表1 不同品種香蕉對(duì)FA的敏感性測定結(jié)果

2.3 巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)抗性目標(biāo)芽的離體篩選

2.3.1 巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)FA半致死濃度的測定 在含不同濃度FA的處理下巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)薄片誘導(dǎo)不定芽的存活率如表2所示，隨著FA濃度的升高，在同一FA濃度下，巴西蕉不定芽的存活率均高于農(nóng)科1號(hào)，計(jì)算得到巴西蕉的半致死濃度為40.63 mg/L、農(nóng)科1號(hào)的半致死濃度為31.82 mg/L。為方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，將35 mg/L設(shè)定為后續(xù)抗性芽篩選的半致死濃度。

表2 巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)FA半致死濃度測定結(jié)果

2.3.2 巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)抗性目標(biāo)芽的篩選根據(jù)2.3.1的試驗(yàn)結(jié)果，我們以35 mg/L的鐮刀菌酸濃度作為半致死濃度對(duì)巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)薄片誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行連續(xù)篩選。在前3次篩選過程中，不定芽長勢和存活率均隨著繼代代數(shù)的增加而減弱，但從第4次以后則趨于穩(wěn)定。在芽的存活率穩(wěn)定后，取健康單芽在不加粗毒素的增殖培養(yǎng)基中增殖1代，再在高劑量粗毒素培養(yǎng)基中進(jìn)一步誘變篩選；當(dāng)芽的存活率進(jìn)一步穩(wěn)定后，選取健康單芽接入不加粗毒素的增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1次，然后再接回半致死濃度粗毒素的增殖培養(yǎng)基中，重復(fù)上面過程，直到最后半致死濃度培養(yǎng)的芽存活率比第1次半致死濃度培養(yǎng)的芽存活率顯著提高并得以穩(wěn)定（表3）。說明經(jīng)粗毒素多次誘變后，兩個(gè)品種香蕉的耐毒素能力得以提高并穩(wěn)定遺傳，最后篩選出最健壯的兩個(gè)芽為抗（耐）病目標(biāo)材料，田間抗性有待進(jìn)一步進(jìn)行苗期接種試驗(yàn)和大田小區(qū)試驗(yàn)。

表3 巴西蕉和農(nóng)科1號(hào)FA抗性目標(biāo)芽的篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

關(guān)于在離體條件下，用香蕉枯萎病菌粗毒素作為壓力來篩選抗（耐）病性突變體的研究報(bào)道較多，研究發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌毒素是一類非?；远舅?，對(duì)不同抗性的香蕉品種均具有明顯的致病作用，但不同香蕉品種對(duì)毒素的敏感性程度與田間真實(shí)的抗病性之間的關(guān)系卻存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，香蕉離體培養(yǎng)芽對(duì)粗毒素的敏感性程度與香蕉品種的抗病性無相關(guān)關(guān)系，這與 Matsumoto［13］和李梅婷［20］的結(jié)果相一致，而與楊秀娟等［21］和Companioni等［22］的研究結(jié)果相反。然而，甘林等［23］研究表明，香蕉組培生根苗的耐毒素能力與品種抗病性有一定的相關(guān)性。國內(nèi)外雖對(duì)尖孢鐮刀粗毒素的誘導(dǎo)、產(chǎn)毒條件及其生物活性雖已有較多研究［24］，但對(duì)枯萎病粗毒素的組成成分和致病機(jī)制研究較少，對(duì)于導(dǎo)致香蕉枯萎病產(chǎn)生的主要致病因子還要進(jìn)行更深入的研究?？梢?，在離體培養(yǎng)增殖階段鑒定品種對(duì)枯萎病的抗性是不確切的，耐毒突變體的抗性機(jī)制也還需要作進(jìn)一步研究。

薄片培養(yǎng)具有細(xì)胞少、面積大、培養(yǎng)過程中可充分接觸培養(yǎng)基等優(yōu)點(diǎn)，通過薄片培養(yǎng)誘導(dǎo)出來的不定芽可以減少嵌合體的出現(xiàn)［25-27］，本研究利用薄片培養(yǎng)誘導(dǎo)出來的不定芽，進(jìn)行連續(xù)粗毒素篩選抗性不定芽以減少嵌合體的發(fā)生，對(duì)保證突變體的穩(wěn)定性具有良好效果。大多數(shù)研究者認(rèn)為，篩選時(shí)采用半致死水平的濃度較為合理［28］。本研究在對(duì)不定芽經(jīng)過粗毒素半致死濃度多次篩選和高濃度篩選后，獲得了耐毒素芽，但對(duì)枯萎病的抗病性還需要通過苗期接種和田間小區(qū)抗病性試驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)。