能源微藻油脂積累及油脂含量檢測技術研究進展

李貴麗 韓志萍 ，魏曉奕 ，周 偉 ，龔 霄 ，李積華

（1.中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所/農業(yè)農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

由于能源短缺問題越來越受到各行業(yè)的關注，研究者逐漸把目光轉向生物柴油的研發(fā)方向，當前生物質柴油的原料大部分來自植物食用油，在供應量上有所限制，因而尋求可再生且滿足大量需求的穩(wěn)定油脂來源是必需的。微藻生物柴油的研究起源于20世紀70年代的第一次石油危機，美國國家可再生能源實驗室在1978—1996年間通過水生物種項目（the Aquatic Species Program, ASP）證明了微藻可用于生產生物燃料。作為單細胞生物，微藻生長快速，代謝能力強，培養(yǎng)周期短且不占用耕地，能通過光合作用將無機碳源等轉化為甘油三酯等脂質成分儲存于細胞［1］，在特定的培養(yǎng)條件下，微藻還能改變細胞內各生物質的組成成分，做到高效的積累油脂。目前對高產脂能力微藻的分離篩選已有諸多報道，如Shihhsin等分離得到的鏈帶藻株Desmodesmus sp.F2, 優(yōu)化后的產油能力能達到302 mg/L·d［2］，也有報道指出部分微擬球藻、綠藻、小球藻［3］產脂能力均能達到細胞干重的45%以上，其單位面積油脂產率為大豆的幾十倍。另外，通過培養(yǎng)階段干預和基因手段還可以提高微藻的油脂積累能力，目前普遍認為培養(yǎng)基中限制氮元素的濃度能提高微藻的脂質積累量［4］，但也有研究指出氮脅迫培養(yǎng)對不同微藻來說還可以積累碳水化合物，而不是油脂［1］；基因層面的研究主要在于微藻脂類代謝遺傳調控，通過控制高產油脂基因或改變油脂合成途徑的關鍵酶酶活以獲得油脂的積累［5］。然而直到今天，微藻生物燃料仍未實現(xiàn)大規(guī)模應用，其瓶頸主要是經(jīng)濟成本高于化石燃料。高額經(jīng)濟成本的原因主要有：一是多數(shù)富油微藻偏愛在溫度較低的環(huán)境中生長，當環(huán)境溫度高于30℃時就出現(xiàn)生長緩慢或死亡的現(xiàn)象，而大范圍連續(xù)式溫度控制耗資巨大［6］；二是一些通過基因技術建立的工程藻，在實驗室生長狀態(tài)良好，在開放池塘卻顯示了諸多不適［6］。同時，微藻受遺傳信息、生長環(huán)境等因素的影響，其油脂累積和產量有很大差異，因此篩選高產油能力微藻、提高其生物量和油脂產率是發(fā)展微藻生物燃料的關鍵所在。綜合現(xiàn)有微藻油脂生產的相關報道，從產油微藻的種類、影響油脂積累的因素、提高油脂累積方法和油脂檢測方法等方面闡述了國內外微藻產油的研究進展，以期為后續(xù)的研究計劃和產業(yè)化提供參考。

1 產油微藻的種類

當前已發(fā)現(xiàn)大約有5萬株產油微藻分布于世界各地, 其總生物量中含有20%～50%的脂肪，這對生物柴油有很好的特性［4］。但因部分生長速率低、生長周期長且產脂能力不足，僅有小部分可能考慮規(guī)模生產生物燃料。目前文獻報道的產油微藻主要集中在四大類，即金藻、小球藻、柵藻和部分綠藻，通過自然環(huán)境下分離純化，分析生物量和產脂能力等指標，評價該藻作為產油微藻的優(yōu)勢和前景，具體已篩選得到的高產脂力的微藻有以下幾種：

1.1 布朗葡萄藻

布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）是一種在世界上廣泛分布的單細胞綠藻,也被稱為“油藻”, 有A、B、L 3種類別，根據(jù)其品種不同，含烴量在20%～80%之間不等［7］。布朗葡萄藻所產烴的組成和結構與石油極為相似, 不同時期藻體細胞中烴類物質含量存在差異，應用透射電鏡對不同時期的藻體進行觀察發(fā)現(xiàn)，對數(shù)期含烴顆粒分布最多［8］。對一株布朗葡萄藻在柱式反應器中培養(yǎng)16 d后,其粗脂質占達到干重的含量為56.6%［9］。以胞外聚合物（EPS）刺激布朗葡萄藻，可使生物膜油脂含量提高3倍左右，且油脂含量、純度、日產率以及中性三酰甘油酯 （TAG）比例都得以提高［10］。

1.2 小球藻

小球藻（Chlorella sp.）是一種真核綠藻，生長速度快，可以有效地固定CO2，有研究發(fā)現(xiàn)，將海洋小球藻接種于鹽度為30的f/2培養(yǎng)基中，在光生物反應器中培養(yǎng)，得到的油脂質量分數(shù)達55.35%［11］；新進分離鑒定得到的小球藻Chlorella vulgaris PQG67在NaCl脅迫條件下, 油脂產率可達40%以上［12］，而利用生產廢水培養(yǎng)的小球藻Chlorella sp.MM3，脂質積累也能達到51%，同時還能去除廢水中的氮和磷酸鹽等成分含量［13］。另外有研究提出，將小球藻與細菌（Stenotrophomonas maltophilia）共培養(yǎng)能促進小球藻的的生長、油脂積累和脂肪酸組分，其油脂含量能提高36.3%［14］。

1.3 等鞭金藻

等鞭金藻在國內廣泛養(yǎng)殖，因其個體小、繁殖快、營養(yǎng)豐富、易被貝類幼蟲捕捉吞食和消化, 是海水魚、蝦、貝類育苗過程中良好的餌料。金藻在未調控培養(yǎng)時油脂平均含量已達到27.1%，比含油綠藻和含油硅藻的平均總脂含量高出了2%～5%［15］。湛江等鞭金藻的平均油脂含量是29.7%，其中不飽和脂肪酸含量占總脂的50%［16］，具有生物燃料、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的開發(fā)前景，該藻經(jīng)常壓室溫等離子體誘變后的油脂產率達到了120.2 mg/L·d,比野生株提高了 21.5%［17］, 穩(wěn)定傳代藻株也表現(xiàn)出高產脂產率。

1.4 鏈帶藻

鏈帶藻屬柵藻科，在我國新疆、西藏等高海拔地區(qū)和云南、臺灣等濕熱地區(qū)均有分布，特殊的生長環(huán)境引起了科研人員的研究熱情。鏈帶藻Desmodesmus sp.F2是從臺灣海峽分離鑒定出來的一株產油微藻［2］，在目前報道的微藻中，該藻具有非常顯著的優(yōu)點：一是耐高溫，其在45℃下培養(yǎng)24 h 和50℃下培養(yǎng)8 h，細胞死亡率均低于5%［2］；二是油脂產率最高，通過優(yōu)化養(yǎng)殖條件，其脂質產量達到細胞干重的60%以上，這是在所有文獻報道中最高的微藻產油率［2］，熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08［18］也具有高溫培養(yǎng)條件下的產脂能力，脂質含量占細胞干重的40.8%

1.5 其他綠藻

綠藻（Neochlori oleoabundans）隸屬于綠藻綱綠球藻科，其油脂質量分數(shù)（干物質）最高達54%，其中三酰甘油酯占總脂質的80%［19］；眼點擬微綠球藻（Nannochloropsis oculata） 、綠色巴夫藻（ Pavlova viridis Tseng）、微擬球藻（Nannochloropsis sp.）的油脂質量分數(shù)分別達到55.77%，46.08%、49.75%［11］，具有較高的產脂能力（表1），這些綠藻中長鏈脂肪酸含量高，且多為中性油脂，在生物柴油開發(fā)方向具有一定研究意義。Abou-Shanab等［20］分離出1株淡水產斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）油脂含量高達58（±1.5）%，這些綠藻在生物燃料生產上具有優(yōu)勢。總的來說，部分鏈帶藻和布朗葡萄藻相對于小球藻、金藻具有較高的油脂含量，同時，在小球藻的培養(yǎng)大約在10 d左右能達到最大生物量，而柵藻需要培養(yǎng)需要10～20 d，但鏈帶藻相較于小球藻具有更強的環(huán)境適應能力，在高溫、高寒、干旱、高海拔等地區(qū)均有柵藻的生長，因此可以根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境和自身需求合理選擇產油藻種。

表1 部分微藻的含油量

2 影響微藻油脂積累的因素

根據(jù)藻細胞的經(jīng)驗分子式C106H181O45N16P［21］，微藻生長需要大量的碳氮磷等營養(yǎng)鹽，這些元素對藻細胞的生長和油脂積累存在顯著影響，同時培養(yǎng)條件的不同對微藻細胞內成分的含量也會存在影響［21］，如培養(yǎng)基中各主要營養(yǎng)元素的添加量、培養(yǎng)光照的強弱［3］、培養(yǎng)溫度的高低［1］、通氣量及各氣體成分比例等因素都會在一定程度上改變細胞代謝產物的含量組成，具體來說影響微藻油脂積累的因素主要有以下幾個方面：

2.1 營養(yǎng)元素

碳作為細胞生長所需的主要營養(yǎng)元素，參與脂代謝的重要代謝途徑。自養(yǎng)微藻可以通過光合作用吸收溶解在水中的CO2作為碳源，或在碳酸酐酶催化下將環(huán)境中的CO32-、HCO3-快速轉化為CO2用于細胞生長［21］。微藻總脂質中，高不飽和脂肪C16和C18含量較高［13］，合成這些脂肪酸需要合適的碳元素供應。楊靜等通過加入葡萄糖將柵藻油脂的產率提高了8倍。但也有研究表明CO2濃度過高，會抑制微藻脂類的積累［22］，這可能是高濃度的CO2降低了環(huán)境的pH值。

氮元素也會影響到脂類物質的積累。當?shù)爻渥銜r，細胞生長速度快，各類有機物均能正常的積累合成；而在氮脅迫環(huán)境下蛋白質等化合物的合成積累受到限制，從而提高了脂類物質的相對含量［22］。謝友坪等［1］通過脈沖式添加氮源對Desmodesmus sp.F51進行培養(yǎng)，探究微藻細胞的生長及生物質組成，結果表明，脈沖添加氮源有利于微藻細胞的生長和碳水化合物的積累，但脂質積累量明顯降低。也有研究指出氮脅迫培養(yǎng)對不同微藻來說還可以積累碳水化合物［7］。

磷元素也參與脂肪酸的轉化過程［23］。李雨晨［24］研究發(fā)現(xiàn)磷充足條件下，微藻細胞主要促進單不飽和脂肪酸的積累,而磷缺乏時，不僅可以促進中性脂積累,還能提高C20∶5、C22∶5等長鏈多不飽和脂肪酸的比重。各元素以化合物的形式作為合成三酰甘油的底物，同時需要參與脂肪酸合成代謝的酶、葡萄糖和載體蛋白等的協(xié)同作用最終形成三酰甘油。

Fe3+是影響微藻油脂積累的重要元素，當Fe3+濃度分別提高2倍和10倍時，能使等鞭金藻（Isochrysis galbana）和杜氏鹽藻（Dunaliella tertiolecta）最大的油脂產率分別增加1.65倍和2倍［25］。另外鈣濃度對微藻生物量和油脂含量具有顯著影響，當鐵、鈣濃度分別為 2×10-5mmol/L和0.05 mmol/L 時，最利于 Desmodesmus sp.WC08 的生長和油脂積累［18］。各元素以化合物或離子的形式作為合成三酰甘油的底物，同時需要參與脂肪酸合成代謝的酶、葡萄糖和載體蛋白等的協(xié)同作用最終形成三酰甘油。

2.2 環(huán)境因素

溫度是影響微藻細胞生長代謝的重要因素之一。研究表明，雖然不同微藻細胞的油脂代謝途徑以及關鍵酶存在差異，但溫度對藻體細胞內油脂合成積累和酶活的影響是一致的［26］，原因可能是在低溫環(huán)境下，微藻細胞的生長代謝和活動都趨于緩慢，脂質的合成效率也較低；隨溫度的逐漸升高，相關的關鍵酶被激活，從而提高了油脂積累的效率；極高溫環(huán)境中酶受高溫活性被抑制或者喪失了酶活，造成不可逆的損傷，無法積累油脂。溫度對于脂肪酸的組成也有影響，有研究指出當溫度降低時，不飽和脂肪酸的含量會有所增加［26］，這也與脂質固化理論（liquid solidfication）觀點一致。

微藻像植物一樣進行光合作用，對光的需求必不可少，當光照強度超過光補償點時，微藻生物量開始積累，光照越強，生物量積累越多，但光強超過光飽和點時，過強的光照會影響光合電子傳遞鏈，造成光氧化脅迫降低生物量。因此，合適的光照條件對微藻的生長至關重要。有研究表明，高光強有利于中性脂質的積累，低光強更易積累極性脂質，通過控制光照強度使其接近光飽和點，可以使光合效率達到最大值［3,27］。CO2通氣量等條件［26］的也會影響微藻的生長速度，通氣量決定了氧氣和碳源供應，進而影響到脂類物質積累。

室外培養(yǎng)時培養(yǎng)裝置的設計對微藻的生長也會產生影響，培養(yǎng)裝置可分為開放的回旋池和封閉的光生物反應器，開敞式回旋池比封閉的光生物池更具成本效益?；匦氐脑O計需要考慮池深度和池中微藻的循環(huán)問題，一般來說，深度通常設計在0.2～0.5 m之間，以保證微藻的高增長率［28］，回旋池內裝有槳輪會在回旋池中產生混合和運動，避免微藻的沉淀。但該系統(tǒng)的缺點之一是水過度蒸發(fā)到大氣中，相對于光生物反應器，微藻對CO2的利用效率較低。此外，回旋池還易受到環(huán)境中其他微生物的影響，造成污染和營養(yǎng)消耗。因此，在目前的回旋池設計中多對其進行遮蓋，以防止污染［10］。光生物反應器利用透明的直玻璃管或塑料管是水平排列、垂直排列、傾斜排列或螺旋排列，選擇合適的管道直徑角度安裝以保證足夠的光滲透到培養(yǎng)基上［9］，從而促進較高的生物量生產率。降低了回旋池培養(yǎng)的污染風險且不需要占用農業(yè)用地。但光生物反應器比開敞式跑道池昂貴得多，用光生物反應器處理工業(yè)廢水需要加以濃縮并轉移到反應器內進一步處理［28］?，F(xiàn)今，利用回旋池和光生物反應器混合系統(tǒng)是一種低成本、高效的培養(yǎng)微藻的方法，在該系統(tǒng)中，在回旋池之前使用閉路光生物反應器來控制或減少來自其他微生物的污染［10］。然后，將密集的微藻細胞轉移到開闊的回旋池中進行進一步的細胞繁殖，以獲得大量的生物量。該系統(tǒng)目前已用于雨生紅球藻的培養(yǎng)［29］，實踐證明，在微藻養(yǎng)殖生產生物柴油中，利用混合系統(tǒng)生產生物柴油的全球升溫潛能值（GWP）和化石能源需求量（FER）分別為42%和38%［5］，與化石柴油相比，生產1 t微藻生物柴油可節(jié)省成本。

3 提高微藻產油量方法

改變微藻生長的環(huán)境條件，可以增加藻體細胞內的油脂合成和累積量。一般來說，有以下幾種途徑：

3.1 篩選高產油脂藻種

從自然界中分離得到的藻株，主要采用兩種方法：一是根據(jù)形態(tài)特點進行初步鑒定，基于微藻生長曲線,生物量和油脂含量等指標測定微藻的產油性，進而對高產藻株進行分子生物學鑒定，通過培養(yǎng)獲得油脂積累［30］，該方法比較可靠，但較費時，不適于大規(guī)模篩選；二是采用油脂含量快速測定進行初步篩選，后進行復篩檢測初篩微藻的生長和產脂量［31］，該方法測定快速，大大節(jié)省了樣品和工作量。Shihhsin等［3］分離得到的鏈帶藻株Desmodesmus sp.F2, 其優(yōu)化培養(yǎng)條件后的產油能力能達到302 mg/（Ld），Araujo等［32］測試了10種微藻產油的可行性，結果顯示纖細角毛藻的油脂含量最高，普通小球藻獲得了最大的油脂產量，季方等［22］從自然水樣中分離篩選出一株生物量較高的微藻屬，通過基因鑒定并命名為 Desmodesmus sp.EJ12-3，并優(yōu)化合適的培養(yǎng)條件得到了最大的生物量的積累。

3.2 優(yōu)化微藻培養(yǎng)條件

篩選得到的藻種還需要進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，主要包括培養(yǎng)溫度、濕度、曝氣量、光照、pH等條件［33］，以提高其生物量和油脂產率。但有研究發(fā)現(xiàn)，微藻的生長和生物質的積累在一定程度上是矛盾的，具有高油脂含量的微藻，其生長速率普遍偏低［34］，因此選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)條件對脂質積累大有裨益。熊偉等［34］利用瓊脂和微孔濾膜構建了生物膜反應器，探究微藻生長和油脂積累情況,實驗表明當瓊脂濃度升高到8%時,微藻細胞直徑從3.87 μm減小到3.35 μm，油脂產量提高了63.39%。另外，營養(yǎng)鹽脅迫處理也能控制生物量和生物質的合成方向［35］，如氮、磷元素脅迫處理對微藻的生長和油脂積累具有調控作用。氮脅迫處理培養(yǎng)微藻Desmodesmus sp.WC08，得到低濃度氮在生長后期更適于微藻Desmodesmus.sp.WC08的生長，氮濃度為10 mmoL/L時最有利于脂質的積累；對磷元素的脅迫處理研究發(fā)現(xiàn)，低濃度磷（0.1～0.5 mmoL/L）培養(yǎng)的Desmodesmus.sp.WC08的油脂含量較高［18］。有研究者提出用兩步培養(yǎng)法富集油脂，即先將微藻接種于營養(yǎng)豐富的環(huán)境中獲得高生物量，后轉接至營養(yǎng)脅迫的環(huán)境中積累油脂［36］，劉婷婷利用氮脅迫培養(yǎng)小球藻在30 h內脂質含量從微藻質量的20%增加到50%。但該法會使積累油脂時間延長，營養(yǎng)不足也會阻礙藻細胞的生長［3,37］。

3.3 基因工程改造

根據(jù)已知的油脂合成代謝途徑，乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase）基因是脂肪酸合成途徑中的關鍵酶，超量表達的ACCase對油脂積累有重要的作用［31］，除此之外，酰基輔酶A、蘋果酸酶、檸檬酸裂合酶等都參與了油脂合成代謝途徑［5,38］。通過現(xiàn)代基因工程手段，改變微藻油脂合成的相關基因，超表達油脂合成的關鍵酶或阻斷競爭中間代謝物的關鍵酶的表達［5］，理論上可獲得高產油能力和遺傳性狀穩(wěn)定的微藻。自1995 年始就已經(jīng)有研究者將（ACCase）基因轉入到小環(huán)藻中；2015年，Gomma等［39］在四尾柵藻（Scenedesmus quadricauda）中導入乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）基因，甘油激酶基因，甘油三磷酸脫氫酶基因，使其在藻體內過表達，得到突變株總脂量比野生藻增加了1.6倍；2016年，Niu選用了三角褐酯藻過表達甘油-3-磷酸轉酰酶（GPAT）基因，使藻體細胞的中性脂的含量增加了2倍［40］，且不飽和脂肪酸含量較野生三角褐藻顯著提高。另外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）是氨基酸合成途徑的關鍵酶，能夠催化乙酰輔酶A合成草酰乙酸，與脂肪酸合成競爭乙酰輔酶A，抑制脂肪酸合成［41］。基因工程改造微藻操作復雜，目前獲得的突變株均存在遺傳穩(wěn)定性不足的問題，有待進一步發(fā)展。

4 微藻細胞油脂的測定

微藻能否用于生物柴油的生產，取決于微藻產脂能力及脂質組成，因此對于微藻油脂含量組成的測定也至關重要，目前應用的油脂測定方法主要是尼羅紅熒光染色法、蘇丹黑B染色法、傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）、氣相色譜-質譜連用（GC-MS）等。以上4種方法都可以做到少量樣品下的脂質含量的快速測定，尼羅紅染色法利用熒光，靈敏度高，樣品處理簡單，但需要針對不同樣品適當改進，蘇丹黑B法靈敏性較低，對樣品均一性要求較高，且只能測定樣品中脂質的相對含量。傅里葉紅外變換紅外光譜法和GC-MS因設備昂貴且樣品前處理較染色法稍顯復雜，因此不如染色法使用廣泛，但此兩種方法的結果更為精確，具有高的分辨率和有較好的重現(xiàn)性，常用于精確的脂質組成成分的含量分析。

4.1 尼羅紅熒光光譜法

尼羅紅是一種親脂性惡嗪類熒光染料，一般用于檢測非極性疏水環(huán)境中的中性油脂。尼羅紅的水溶液或DMSO溶液可以穿過多種微藻的細胞膜，與脂類物質結合，在480 nm的激發(fā)波長下顯示強烈的橘紅色熒光，以此測定胞內油脂的相對含量。具體方法為：取2 mL藻液與5 μL尼羅紅染液（濃度為0.1 mg/m L丙酮）混勻后避光放置5 min, 用熒光分光光度計測定480 nm光激發(fā)熒光值和585 nm波長處的熒光值,利用測定的熒光值減去混合液在該波長處的自發(fā)熒光值即為染色后的相對熒光值［42］。對于一些細胞壁較厚的微藻，常規(guī)的尼羅紅不易滲入胞內染色，所以張敬健等［43］對該方法進行了改進，先用微波預處理微藻40 s，并結合體積分數(shù)為1%的二甲基亞楓，濃度為1.5 μg /mL尼羅紅染液，在40℃下染色5 min。得到了最佳的染色條件，并用于斜生柵藻的油脂測定中。該種方法直接快速，對于脂質含量較低的藻體檢測十分有效。

4.2 蘇丹黑B染色法

蘇丹黑B也是一種脂溶性染料，可與中性油脂生成黑色或藍黑色的絡合物，在645 nm下測定生成絡合物的吸收峰，其吸收峰的峰值和峰面積與微藻總脂質質量分數(shù)間呈線性關系。具體方法為: 準確稱取0.6 g蘇丹黑B粉末溶于100 mL 95% （體積分數(shù),下同） 的乙醇中,混勻后沸水浴加熱10 min，冷卻后在4℃下離心收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾后保存?zhèn)溆?。后取蘇丹黑B染液與超聲破碎的濕藻泥充分混勻,沸水浴20 min, 冷卻后在4℃離心10 min。取下層沉淀用50% 的乙醇洗滌3次，最后加入70% 的乙醇混勻, 用紫外分光光度計在645 nm波長下測定其吸光度［44］，以此可測定微藻細胞中性油脂的總含量。彭悅等［44］采用該方法測定了球等鞭金藻和小新月菱形藻的油脂含量和利用溶劑提取法所得油脂含量基本一致，證實了該方法的可行性。

4.3 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）是一種理想的油脂測定方法，油脂中的不飽和脂肪酸在紅外光譜的3 000～3 100 cm-1區(qū)域有伸縮振動吸收峰，利用邁克遜干涉儀按照一定速度變化形成干涉光,再與微藻油脂形成作用產生干涉信號，該信號經(jīng)收集后進行傅立葉變換形成干涉圖，進而還原光譜圖，通過分析紅外光譜圖中相關吸收峰的位置、形狀等進行有機物的快速的定性定量分析。FTIR 還可以用于測定細胞中各生化組分含量，包括脂質、蛋白質和碳水化合物等。能對微藻細胞組分進行精確的分析比對［45］。

4.4 氣相色譜-質譜聯(lián)用法

氣相色譜-質譜聯(lián)用法（GC-MS）是檢測微藻油脂含量及脂肪酸組成的最常用的定性定量測定方法。一般來說，微藻先經(jīng)過NaOHCH3OH溶液皂化后經(jīng)三氟化硼/甲醇（1∶2，V/V）恒溫水浴搖勻以分離脂肪層，或利用硫酸甲醇溶液在80℃ 水浴抽提，抽提后通過加入等份的蒸餾水正己烷萃取脂肪酸，將上層萃取液取出后氮氣吹干,再復溶于正己烷中［46］進行色譜質譜分析，得到的結果直接對比質譜圖譜，用NIST08.LIB質譜數(shù)據(jù)庫測定其保留指數(shù)。彭悅等［44］利用GC-MS探究了球等鞭金藻和小新月菱形藻的油脂含量及其組成，得到兩株微藻細胞內各脂肪酸的種類和所占比例，石?。?6］利用GC-MS法測定了不同營養(yǎng)元素濃度下的微藻脂肪酸組成情況和油脂含量的比較，所得數(shù)據(jù)精確，削弱了油脂含量快速測定的誤差。

5 展望

利用微藻作為生物柴油原料的構想，雖在1980年就有學者提出，但一直未能實現(xiàn)，近年來的能源短缺問題和新能源的開發(fā)又讓微藻生物能源的開發(fā)重新受到關注。相關研究指出，隨著微藻培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術的不斷改進，微藻成為生產新型可再生能源的主要原料成為可能。目前對于微藻油脂的研究主要集中于從自然界篩選野生藻株的培養(yǎng)條件優(yōu)化上，而未經(jīng)人工導向的野生藻株在油脂積累能力上仍存在限制，因此，基因工程技術對野生藻株馴化是解決產油能力的首選，但基因工程研究還處于初步階段，對于微藻油脂合成檢測技術也比較復雜繁瑣，且檢測設備昂貴，另外實驗室高密度培養(yǎng)的微藻在進一步中試后能否用于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)尚需要進一步研究驗證，針對生物柴油的大規(guī)模工業(yè)化生產仍然存在著很多障礙。未來或可以在生物柴油的菌種選擇培養(yǎng)、生物反應器的設計應用、生物油脂產量優(yōu)化和生物油脂的提取檢測等重要的生產環(huán)節(jié)進一步探究細化并加以改進，從而解決當前能源短缺的問題，建立可再生能源生產鏈。