象草不同輻射劑量誘變系表型及遺傳變異研究

武炳超，張歡，童磊，杜昭昌，胡家菱，陳燚，張新全，劉偉，黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

狼尾草屬(Pennisetum)隸屬禾本科黍亞科, 蒺藜亞族, 為一年生或多年生禾本科牧草, 主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū), 全世界約140種, 多數(shù)原產(chǎn)于非洲[1]。我國人工栽培利用的品種主要有多年生的象草(P.purpureum)、一年生的美洲狼尾草(P.americanum)及二者之間的雜交種等。

象草，別名紫狼尾草。20世紀(jì)40年代初，我國的四川、廣東從印度、緬甸引入試種，后傳入湖南、江蘇、福建等地，目前我國南方各省均有栽培[2]。象草是一種莖稈粗高、含糖量大、粗蛋白和無氮浸出物含量高的優(yōu)良牧草[3]。1975年，廣東、廣西等地一些畜牧場(chǎng)大面積種植象草飼喂奶牛，取得良好成效[4]。象草因其生長(zhǎng)速度快、適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富等特點(diǎn)被多種家畜喜食，其多作為青刈飼料，也可以青貯或者調(diào)制干草[5]。象草不僅僅是一種優(yōu)良的牧草，它還是一種重要的生物質(zhì)能源植物。美國在20世紀(jì)80年代展開了將象草作為能源植物的研究工作，證明了其可以用于乙醇、沼氣和電能的生產(chǎn)[6-9]。除此之外，象草還通過其高大的植株、豐富的葉片、分蘗以及發(fā)達(dá)的根系保護(hù)了土表，發(fā)揮著重要的生態(tài)效益[10]。近年來，因其株型優(yōu)美、抗逆性強(qiáng)、管理粗放、維護(hù)費(fèi)用低等特點(diǎn)，已成為一種新型的園林造景植物[11]。

目前我國的國審狼尾草品種中有6個(gè)是象草品種，其中4個(gè)為引進(jìn)品種，品種資源匱乏已經(jīng)成為象草進(jìn)一步育種和利用的障礙。象草為4倍體，有28條染色體[12]。由于不能形成花粉或者雌蕊發(fā)育不良，因而一般不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低，種子活性低，生產(chǎn)多用種莖繁殖，種質(zhì)資源遺傳多樣性低，限制了其育種利用[13-14]。誘變育種技術(shù)作為一種有效創(chuàng)造新種質(zhì)的育種手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物育種研究中[15]。其中γ射線可以通過輻射能量使生物體內(nèi)各種分子產(chǎn)生電離和激發(fā)，形成自由原子或者基團(tuán)，他們相互反應(yīng)并與周圍大分子核酸和蛋白質(zhì)起反應(yīng)，引起染色體結(jié)構(gòu)變異，主要為易位、倒位和缺失[16-17]。為了創(chuàng)制新的象草種質(zhì)資源，豐富象草種質(zhì)資源多樣性，本實(shí)驗(yàn)用60Co-γ射線照射受體材料，對(duì)誘變系材料表型性狀變異進(jìn)行初步研究，并輔以分子標(biāo)記的方法比較誘變系與對(duì)照材料之間的遺傳差異，探究輻射誘變對(duì)象草遺傳變異的影響，并確定最適宜的輻射誘變劑量，為以后的誘變系選育和品種改良提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種植在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都崇州實(shí)驗(yàn)基地的象草061023003,來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草種質(zhì)基因庫，均為同一無性系擴(kuò)繁所得，以保證所選材料遺傳背景相同。挑選長(zhǎng)勢(shì)相近且健康的植株割取種莖，種莖標(biāo)準(zhǔn)為含有2～3個(gè)莖節(jié)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1象草臨界劑量與半致死劑量確定 2016年4月，將待輻射的種莖送往四川省農(nóng)科院輻射中心，采用60Co-γ射線進(jìn)行照射，在運(yùn)送過程中通過灑水保持種莖濕潤(rùn)以減弱缺水對(duì)種莖的傷害。結(jié)合以前的研究，本試驗(yàn)共設(shè)置了3個(gè)劑量梯度：10、20和30 Gy，劑量率1 Gy·min-1，以沒有經(jīng)過輻射處理的材料作為對(duì)照。每個(gè)劑量梯度分別輻射66個(gè)種莖。將輻射后的種莖種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州實(shí)驗(yàn)基地，莖稈傾斜插入土壤，以土壤覆蓋一個(gè)莖節(jié)為準(zhǔn)，株距1 m，行距2 m，常規(guī)大田栽培管理，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。其中，存活率為50%時(shí)的劑量為半致死劑量，存活率為40%時(shí)的劑量為臨界劑量[18]。

1.2.2植株表型性狀測(cè)定 等待存活的植株生長(zhǎng)成熟后，對(duì)每個(gè)誘變系群體隨機(jī)選取15株進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)測(cè)定。共測(cè)定6個(gè)指標(biāo)，包括株高，分蘗數(shù)，莖節(jié)數(shù)，葉長(zhǎng)，葉寬及莖粗。其中葉長(zhǎng)、葉寬兩個(gè)指標(biāo)選擇從下至上倒數(shù)第2片葉子進(jìn)行測(cè)量，葉寬選擇葉片最寬處測(cè)量。除自然高度和分蘗數(shù)以外，其余指標(biāo)均重復(fù)測(cè)量5次。

1.2.3SSR分子標(biāo)記 3個(gè)誘變系群體選擇的植株同表型分析的植株，對(duì)每個(gè)存活材料隨機(jī)挑選2片健康的葉片，采用DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit (Qigene公司，美國)提取DNA。用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，合格DNA樣品用TE稀釋至20 ng·μL-1。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括DNA 1.5 μL(20 ng·μL-1)，Taq酶0.3 μL，Master Mix 7.5 μL，上游引物和下游引物各0.6 μL(10 pmol·μL-1)，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠在350 V電壓下電泳155 min，再用濃度為1 g·L-1的AgNO3染色15 min，顯影后照相保存。引物由本課題組象草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)，序列交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。以3個(gè)誘變系群體中形態(tài)變化差異較大的單株DNA為模板，從50對(duì)SSR引物中篩選出20對(duì)多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、條帶清晰的引物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)于形態(tài)指標(biāo)采用Microsoft Excel 2007軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。對(duì)電泳得到的膠片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：在相同遷移位置，對(duì)穩(wěn)定且清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立原始矩陣。根據(jù)表征矩陣，利用Excel 2007統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)(total number of bands,TNB)和多態(tài)性條帶數(shù)(number of polymorphic bands,NPB)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占的比率(percentage of polymorphic bands,PPB)和引物多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)。使用Popgene 32軟件計(jì)算3個(gè)誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)及多態(tài)性百分率,利用NTSYSpc 2.1(Version 2.10s)軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity coefficient,GSC)并用Past 3繪制UPGMA聚類圖，以探究誘變系與對(duì)照材料間的親緣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 象草輻射后存活率

經(jīng)過60Co-γ射線輻射后，得到3個(gè)誘變系群體，植株存活率隨著輻射劑量的增加而降低。當(dāng)劑量為10 Gy時(shí)，存活植株數(shù)為62株，存活率為93.94%，輻射劑量為20 Gy時(shí)，存活植株數(shù)為49株，存活率為74.24%，而當(dāng)劑量為30 Gy時(shí)，植株存活數(shù)為28株，存活率為42.42%，而對(duì)照組植株存活率為100%，預(yù)測(cè)30 Gy可能是象草的誘變適宜劑量。

2.2 未輻射象草與誘變系群體材料的表型差異

在3個(gè)誘變系群體中分別隨機(jī)選取15株進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)3個(gè)誘變系群體中均有一個(gè)或多個(gè)形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照組群體存在顯著或極顯著差異(表1)。其中，10 Gy誘變系群體中，僅有葉長(zhǎng)一個(gè)指標(biāo)與對(duì)照群體差異顯著；20 Gy誘變系群體中株高、葉長(zhǎng)、葉寬3個(gè)形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照群體差異顯著，其中葉長(zhǎng)和葉寬兩個(gè)指標(biāo)均達(dá)到極顯著差異水平；30 Gy誘變系群體中，共有4個(gè)形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照群體差異顯著，其中株高和葉寬與對(duì)照群體差異極顯著。

進(jìn)一步對(duì)3個(gè)群體各形態(tài)變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算(表2)，結(jié)果表明，除了葉長(zhǎng)外，其余形態(tài)變異系數(shù)均在30 Gy誘變系群體中最大，說明該群體是差異最明顯的誘變系群體。對(duì)3個(gè)群體中不同形態(tài)變異系數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在10 Gy群體中最容易發(fā)生變異的形態(tài)依次為葉長(zhǎng)、分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)；在20 Gy群體中，最容易發(fā)生變異的形態(tài)依次為莖節(jié)數(shù)、葉長(zhǎng)、分蘗數(shù)；而在30 Gy群體中，依次為莖節(jié)數(shù)、分蘗數(shù)、葉長(zhǎng)。由此可見，分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長(zhǎng)對(duì)60Co-γ射線最為敏感，容易在受到輻射后發(fā)生變異。

表1 不同劑量輻射誘變系形態(tài)變異Table 1 The morphological variation of mutants by different dose of radiation

注： *代表在0.05水平與對(duì)照差異顯著；**代表在0.01水平與對(duì)照差異極顯著。

Note: * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表2 各誘變系不同形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)Table 2 The coefficient of variation of morphological in different mutants group (%)

2.3 SSR標(biāo)記差異

2.3.1遺傳多樣性分析 篩選出的20對(duì)引物共擴(kuò)增出116條清晰可見的條帶，擴(kuò)增片段大小為50～300 bp(圖1)，其中多態(tài)性條帶91條，多態(tài)性條帶比率為78.45%。每對(duì)SSR引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為3～8條，平均條帶數(shù)為5.8條，多態(tài)性條帶數(shù)為1～8條，平均為4.6條。多態(tài)信息含量(PIC)在0.032～0.758，平均為0.273，其中引物c104424_g1的PIC最大，引物c106150_g1的PIC最小(表3)。對(duì)3個(gè)誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)及多態(tài)性百分率進(jìn)行比較(表4)，發(fā)現(xiàn)在30 Gy誘變系群體中的4項(xiàng)指標(biāo)均高于另外兩個(gè)誘變系群體，說明30 Gy的60Co-γ射線較另外兩個(gè)劑量能引起更多的遺傳變異，更加豐富的基因多樣性。

圖1 引物c100123_g1擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The amplification product electrophoresis of primer c100123_g1 M代表Marker，A1～A7分別代表F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54，B1～B6分別代表F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54，C1～C7分別代表F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44，CK代表對(duì)照材料。M stands for Marker; A1-A7 represent F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54, respectively; B1-B6 represent F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54, respectively; C1-C7 represent F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44, respectively; CK stands for control material.

2.3.2遺傳相似性及SSR標(biāo)記位點(diǎn)差異分析 根據(jù)SSR引物擴(kuò)增出的條帶，計(jì)算各誘變系群體與對(duì)照材料之間的遺傳相似系數(shù)。從表5中可知，對(duì)照材料與誘變系材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.3793～0.9741，平均值為0.8565。3個(gè)誘變系群體與對(duì)照材料的遺傳相似系數(shù)有一定差異，在10 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數(shù)在0.8017～0.9655，平均為0.8856；在20 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數(shù)為0.7069～0.9741，平均為0.8563；在30 Gy群體中，遺傳相似系數(shù)為0.3793～0.9655，平均為0.8276。說明30 Gy誘變系群體與對(duì)照材料遺傳差異最大，發(fā)生的變異最多。在所有的誘變系材料中，F(xiàn)30-41與對(duì)照材料的遺傳相似系數(shù)最小，為0.3793，該材料與對(duì)照材料的遺傳差異最大，而F20-44與對(duì)照材料的遺傳相似系數(shù)最大，為0.9741，說明與對(duì)照材料的遺傳差異最小，親緣性最近。

表3 20對(duì)SSR引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 3 20 SSR primers used in this study and their amplification results

表4 3個(gè)誘變系群體基于SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphism analysis of three mutants based on 20 SSR

表5 誘變系與對(duì)照材料間的遺傳相似系數(shù)Table 5 The genetic similarity coefficient between mutants and control materials

注：編號(hào)“F數(shù)字1-數(shù)字2”的數(shù)字1是輻射劑量，數(shù)字2是植株編號(hào)。下同。

Note: ID: “F number 1- number 2”, where number 1 is the dose of60Co-γ and number 2 is the plants’ number. The same below.

表6 對(duì)照材料與誘變系間的SSR標(biāo)記差異Table 6 The difference of SSR markers between the base material and its mutants

圖2 誘變系的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of mutants

根據(jù)擴(kuò)增條帶， 對(duì)誘變系材料和對(duì)照材料間的差異位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表6)。發(fā)現(xiàn)在10 Gy誘變系材料與對(duì)照材料間的差異位點(diǎn)數(shù)在4～23個(gè)，平均13.3個(gè)；20 Gy誘變系材料與對(duì)照材料間的差異位點(diǎn)數(shù)在3～34個(gè)，平均16.7個(gè)；而30 Gy誘變系材料與對(duì)照材料間的差異位點(diǎn)數(shù)在4～66個(gè)，平均為19.3個(gè)。其中F30-41差異位點(diǎn)數(shù)達(dá)到66個(gè)，差異位點(diǎn)百分率為56.9%，說明該材料與對(duì)照材料間的遺傳差異最大。其次是F30-39，差異位點(diǎn)數(shù)達(dá)到65個(gè)，差異位點(diǎn)百分率為56.0%；而F20-44僅有3個(gè)差異位點(diǎn)，差異位點(diǎn)百分率為2.6%，說明該材料與對(duì)照材料間的遺傳差異最小。該結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果一致，均說明當(dāng)象草莖稈受到30 Gy的60Co-γ射線輻射時(shí)，更易引起變異。

圖3 突變體F30-39Fig.3 Mutants F30-39

2.4 UPGMA聚類分析

進(jìn)一步對(duì)輻射后誘變系材料進(jìn)行非加權(quán)平均法(UPGMA)聚類分析，以進(jìn)一步探究不同輻射劑量所得誘變系材料與對(duì)照材料之間的親緣關(guān)系。以所得條帶原始矩陣構(gòu)建親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(圖2)。由圖可見，所有材料可分為兩類，F(xiàn)30-39(圖3)與F30-41聚為一類且與對(duì)照材料遺傳距離最遠(yuǎn)，說明它們的變異程度最大。而F20-44與對(duì)照材料聚為一類，說明幾乎沒有發(fā)生變異。而其他誘變系材料在不同距離與對(duì)照材料分開，說明其受到60Co-γ射線照射后，均產(chǎn)生不同程度的變異。

3 討論

不同的物種以及不同部位輻射對(duì)60Co-γ射線的敏感性不同，因此篩選最適宜的誘變劑量是輻射誘變育種的基礎(chǔ)。王文恩等[19]使用60Co-γ射線輻射野牛草(Buchloedactyloides)干種子，初步確定了促進(jìn)野牛草干種子萌發(fā)的適宜輻射劑量為100～150 Gy，而日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)干種子輻射育種的半致死劑量為480 Gy[20]。以象草種莖為輻射材料進(jìn)行誘變的報(bào)道較少，采用3個(gè)劑量的60Co-γ射線對(duì)象草種莖進(jìn)行輻射，發(fā)現(xiàn)30 Gy誘變系群體的存活率為42.42%，接近臨界劑量的存活率，故推測(cè)30 Gy為象草種莖輻射誘變的適宜劑量。

象草不僅可以為草食動(dòng)物提供大量?jī)?yōu)質(zhì)牧草[21]，還具有一定的觀賞效果[22]。對(duì)輻射誘變系與對(duì)照材料表型性狀進(jìn)行測(cè)定和分析是發(fā)現(xiàn)新品系的基礎(chǔ)。曾捷等[23]用60Co-γ射線輻射扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)后，發(fā)現(xiàn)75%的誘變系葉片變小、株高變矮、莖變細(xì)。張彥芹等[24]也通過利用60Co-γ射線輻射高羊茅(Festucaelata)分化苗，得到了葉片變小、變細(xì)的高羊茅突變體。對(duì)狗牙根(Cynodondactylon)進(jìn)行輻射誘變后，發(fā)現(xiàn)草層高度顯著降低，并且顯著影響了葉寬、葉長(zhǎng)及節(jié)間直徑和密度[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3個(gè)誘變系群體的株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、葉長(zhǎng)及葉寬等形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照材料相比，均有一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)顯著或極顯著減小，其中分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長(zhǎng)對(duì)60Co-γ射線最敏感，變異系數(shù)較高。此結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，輻射誘變更傾向于產(chǎn)生植株變小的突變體[23-24]。其中，F(xiàn)10-42和F10-49的株高和莖節(jié)數(shù)均大于對(duì)照材料，是將來進(jìn)行牧草育種的有潛力的新種質(zhì)。

SSR標(biāo)記是共顯性分子標(biāo)記，多態(tài)性豐富、易于鑒別基因型，被認(rèn)為是最好的研究群體遺傳變異的分子標(biāo)記之一[26]。例如黃婷等[27]利用SSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)多花黑麥草(Loliummultiflorum)品種進(jìn)行遺傳差異分析并對(duì)品種進(jìn)行有效的鑒定。本試驗(yàn)通過篩選得到的20對(duì)SSR引物，對(duì)3個(gè)誘變系群體與對(duì)照材料的遺傳差異進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)30 Gy誘變系群體的基因多樣性為0.36，Shannon信息指數(shù)為0.51，多態(tài)性位點(diǎn)89個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率76.72%，遺傳相似系數(shù)為0.8276，差異位點(diǎn)數(shù)19.3個(gè),均大于10和20 Gy誘變系群體，表明該劑量更易產(chǎn)生豐富的遺傳變異。對(duì)所有誘變系群體進(jìn)行UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)F30-39和F30-41聚為一類，與對(duì)照材料距離最遠(yuǎn)，說明其遺傳差異最大，而其他材料也與對(duì)照材料不同程度的分開，說明不同劑量的60Co-γ射線均有可能產(chǎn)生突變體。甘蔗(Saccharumofficinarum)品種桂糖22號(hào)就是由60Co-γ射線輻射誘變育成的[28]。劉天增等[29]利用輻射誘變方法篩選海濱雀稗(Seashorepaspalum)突變體。甜菜(Betavulgaris)的耐旱突變體也是由輻射得到的，并且用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行了鑒定[30]。秦家友等[31]利用SSR標(biāo)記對(duì)玉米(Zeamays)輻射誘變系進(jìn)行遺傳差異研究，發(fā)現(xiàn)誘變系與基礎(chǔ)材料間存在真實(shí)的遺傳差異，本研究結(jié)果與此一致。本研究的結(jié)果僅僅鑒定了不同誘變系群體與對(duì)照材料之間分子水平上的遺傳差異，確定了最適宜象草種莖輻射的60Co-γ射線劑量，對(duì)于突變體的突變?cè)蛞约翱赡馨l(fā)生突變的基因的鑒定還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

不同劑量的60Co-γ射線均可誘導(dǎo)象草發(fā)生變異，其中分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長(zhǎng)對(duì)60Co-γ射線最為敏感，容易發(fā)生突變。結(jié)合不同劑量輻射誘變系表型及遺傳變異的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)30 Gy的誘變效率最高，可作為最適宜象草種莖輻射誘變的劑量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)顯著矮小化的突變體F30-39和F30-41，可為象草后續(xù)育種及基因挖掘研究提供材料。