羊草種子萌發(fā)相關(guān)基因的篩選及表達分析

劉書，劉盼盼，楊偉光，齊冬梅，李曉霞*，劉公社*

(1.中國科學院植物研究所，北京 100093；2.中國科學院大學，北京 100049；3.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

種子的萌發(fā)需要適宜的溫度條件，有些植物種子的萌發(fā)需要變化的溫度[1]。種子的活力和相關(guān)代謝對溫度信號的響應(yīng)是萌發(fā)的關(guān)鍵，溫度能夠直接影響種子萌發(fā)或間接地通過調(diào)節(jié)種子休眠以影響種子萌發(fā)。種子在開始萌發(fā)的過程中，低溫信號可導致種子內(nèi)部激素含量的變化，調(diào)控種子萌發(fā)[2]；溫度的變化也能夠影響種子休眠，較高的環(huán)境溫度中種子休眠度深，而低溫對于種子破除休眠有著非常關(guān)鍵的作用[3]。

種子萌發(fā)調(diào)控中，激素之間的協(xié)同和拮抗有重要作用[4]。ABA與GA是關(guān)鍵的兩種萌發(fā)調(diào)控激素，其各自的合成與代謝形成的種子內(nèi)激素含量的平衡決定種子的生理狀態(tài)，以溫度為代表的環(huán)境信號通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑作用于激素的合成代謝途徑，導致激素含量的變化，從而影響種子的萌發(fā)[5]。在植物體內(nèi)，GA和ABA的合成代謝基因及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因已被大量鑒定。GA促進種子萌發(fā)的過程中，調(diào)控GA合成的關(guān)鍵基因是GA3ox1和GA3ox2[6]，而GA2ox調(diào)控GA的降解，GID1是GA信號通路中的關(guān)鍵基因[7]。ABA抑制萌發(fā)，拮抗GA的促進作用[8-9]，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxy-carotenoid oxygenase，NCED)是ABA合成途徑中的兩個關(guān)鍵酶，而CYP707A2是ABA降解的關(guān)鍵基因[10-11]，PP2Cs在ABA信號轉(zhuǎn)導中有重要作用[12]。有研究表明，低溫能上調(diào)GA合成代謝基因(AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1)和下調(diào)GA分解代謝基因(AtGA2ox2)，從而提高種子內(nèi)活性GA的含量，進而促進萌發(fā)[13]。高溫使ABA合成相關(guān)基因NCED2，NCED5和NCED9的表達上調(diào)，導致ABA水平上升，并抑制GA合成途徑基因的表達，使種子萌發(fā)受到抑制[14-15]。此外，細胞壁松弛蛋白能夠軟化胚乳組織，促進細胞壁解聚，幫助胚根伸出[16]。已有研究表明細胞壁松弛蛋白編碼基因EXPA1，EXPA2，EXPA3，EXPA8，EXPA9和EXPA20等在吸漲的種子中表達量顯著提高，因此細胞壁松弛蛋白在促進種子萌發(fā)中有著非常重要的作用[17-18]。

羊草(Leymuschinensis)是我國重要的禾本科牧草[19]，應(yīng)用價值高，但種子萌發(fā)率偏低限制了羊草種子的生產(chǎn)應(yīng)用[20]。已有研究表明變溫能夠促進羊草種子萌發(fā)，而恒溫不利于其萌發(fā)[21-27]；并且本實驗室已對羊草種子的萌發(fā)條件進行了大量實驗，發(fā)現(xiàn)相較恒溫28 ℃條件，變溫(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)可顯著提高羊草種子萌發(fā)率。本研究在確定羊草種子響應(yīng)變溫信號敏感期的基礎(chǔ)上，結(jié)合前期變溫處理羊草種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對初選的24個可能與種子萌發(fā)、休眠及低溫響應(yīng)與激素代謝等相關(guān)的基因進行定量分析，篩選出與變溫萌發(fā)有關(guān)的關(guān)鍵基因，并對其在種子萌發(fā)初期的表達進行了初步分析，旨在為羊草種子萌發(fā)早期的分子機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的羊草種質(zhì)為SF2-1和XQ10-1，本研究組前期研究已表明其萌發(fā)率存在顯著差異。羊草材料均種植于中國科學院植物研究所(北京)羊草種質(zhì)資源圃，在自然條件下生長，于2014年收獲種子供試。

1.2 實驗方法

1.2.1羊草種子萌發(fā)不同時段變溫處理 取直徑9 cm鋪有浸濕濾紙的玻璃平皿，將人工挑選的50粒飽滿種子均勻地排列在濾紙上，平皿中加入5 mL蒸餾水使濾紙充分吸水濕潤，4次重復。將皿蓋傾斜45°蓋于平皿上，平皿和皿蓋一起放入托盤內(nèi)，托盤內(nèi)倒入1 cm深的蒸餾水。將托盤放入人工氣候箱(相對濕度65%)。對處于28 ℃恒溫條件下進行萌發(fā)的SF2-1和XQ10-1種子，在不同的時間段(第0～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h、48～60 h、60～72 h)以16 ℃低溫處理12 h后，繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)12 d。以持續(xù)處于恒溫28 ℃條件下萌發(fā)的種子作為對照，測定各處理中最終的種子萌發(fā)率(變溫處理后的第12天)，4次重復。發(fā)芽標準為胚根伸出1 mm。

1.2.2羊草種子總RNA提取與cDNA合成 以1.2.1的羊草種子萌發(fā)的方法，取恒溫(28 ℃)1 d和變溫(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)處理1 d后的羊草種子，用濾紙吸干種子表面水分，液氮處理后，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

采用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)分別提取各溫度處理的羊草種子中的總RNA，利用DNase I (TIANGEN)消化基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并使用Biodropsis BD-2000測定RNA濃度和純度。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time 編號：RR037Q)進行cDNA合成，反應(yīng)體系為10 μL：5×PrimeScript?Buffer(2 μL)，PrimeScript?RT Enzyme Mix I(0.5 μL)，OligodT Primer(50 μmol·L-1)(0.5 μL)，Random 6 mers(100 μmol·L-1)(0.5 μL)，Total RNA(500 ng)，RNase-Free ddH2O(補足至10 μL)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。合成后的cDNA存貯于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3羊草種子萌發(fā)變溫處理轉(zhuǎn)錄組測序 前期研究組選取萌發(fā)率較高的羊草種質(zhì)SF2-1的種子，以恒溫(28 ℃)12 h萌發(fā)的種子作為對照組，變溫(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)1 d和恒溫(28 ℃)24 h萌發(fā)種子作為實驗組，進行轉(zhuǎn)錄組測序，并對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)深度分析。

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的初步分析結(jié)果，篩選與高等植物種子萌發(fā)過程中的生理變化和激素代謝，以及與低溫響應(yīng)相關(guān)的24個候選基因(表1)，并以轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中這24個基因在不同溫度條件下的RPKM值利用R語言制作基因表達熱圖。

1.2.4基因表達定量分析 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)初步篩選的24個候選相關(guān)基因的CDS序列設(shè)計熒光定量引物，以羊草Actin基因序列設(shè)計內(nèi)參引物(表1)，以恒溫處理為對照，通過定量PCR(qRT-PCR)分析相關(guān)基因在高、低萌發(fā)率羊草種質(zhì)于變溫處理下萌發(fā)中的表達變化。定量PCR體系和條件按照TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)程序為：95 ℃，30 s；45個循環(huán)(95 ℃，5 s；68 ℃，30 s)。技術(shù)重復3次。定量PCR反應(yīng)完成后，采用2-ΔΔCt方法對所得數(shù)據(jù)進行相對定量分析[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010軟件完成統(tǒng)計分析，圖表制作使用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0軟件。采用單因素方差分析和LSD最小顯著差異法檢驗不同變溫時段羊草種子萌發(fā)率以及各基因相對表達量的差異性。使用R語言制作基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草種子萌發(fā)對不同時段變溫處理的響應(yīng)

為了探究羊草種子萌發(fā)過程中對變溫信號的響應(yīng)，以12 h為梯度的變溫處理萌發(fā)實驗結(jié)果表明：與對照相比，不論是高萌發(fā)率種質(zhì)SF2-1，還是低萌發(fā)率種質(zhì)XQ10-1，在萌發(fā)的第12 h之后的任何時段進行低溫處理，其萌發(fā)率均極顯著(P<0.01)提高，表明羊草種子在萌發(fā)的第12 h已經(jīng)開始響應(yīng)變溫信號。在低萌發(fā)率種質(zhì)XQ10-1中對各低溫處理時段的LSD分析表明，第12～24 h進行低溫處理的萌發(fā)率與恒溫對照以及第0～12 h低溫處理相比，均有極顯著提高(P<0.01)，而在第12～24 h之后的12 h時段低溫處理后的萌發(fā)率與第12～24 h處理相比差異不顯著；在高萌發(fā)率種質(zhì)SF2-1中進行LSD分析，在第12～24 h低溫處理極顯著地提高了萌發(fā)率，但相比于第12～24 h，在第24～36 h低溫處理仍表現(xiàn)出萌發(fā)率的顯著提高(P<0.01)，且在各時段處理中的調(diào)高幅度最大。通過兩個種質(zhì)中不同時段低溫處理后的萌發(fā)率差異可以得出，第12～24 h是羊草種子響應(yīng)低溫信號的關(guān)鍵時段，詳見圖1。

2.2 羊草種子萌發(fā)相關(guān)基因的篩選

依據(jù)羊草種子萌發(fā)不同時段變溫處理實驗結(jié)論“第12～24 h是羊草種子響應(yīng)低溫信號的關(guān)鍵時段”，選取了高萌發(fā)率種質(zhì)SF2-1的種子進行了變溫處理轉(zhuǎn)錄組測序，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的各基因的RPKM值，對初步篩選的24個可能與羊草種子萌發(fā)、休眠及低溫相關(guān)的基因進行熱圖分析，得到不同溫度條件下基因的差異表達情況(圖2)。

結(jié)果表明：與恒溫(28 ℃ 12 h)對照相比，16 ℃低溫處理12 h后，表達明顯上調(diào)的基因有SAIN1，PP2C62，EXPB3，EXPB4，GA3ox，EXPA2和EXPA7，而表達明顯下調(diào)的基因有bHLH49，GID1，ABI8，Chi1，11833，CBF3，NAC2，PP2C72，SAIN2和5423。與恒溫28 ℃ 12 h對照相比，恒溫28 ℃處理24 h后，表達明顯上調(diào)的基因有SAIN1，PP2C62，PYL8，GID8，ABI8，SPATULA和ROS1，而表達明顯下調(diào)的基因有GA2ox，ZEP，EXPA5，EXPB16，Chi1，11833，CBF3，NAC2，PP2C72和5423。與對照相比，兩組不同的溫度處理中，表達均明顯上調(diào)的基因有SAIN1，PP2C62和EXPB3，而在兩種溫度處理中表達均明顯下調(diào)的有Chi1，11833，CBF3，NAC2，PP2C72和5423。

2.3 羊草種子變溫萌發(fā)中相關(guān)基因的表達變化

以恒溫處理為對照，對各基因在變溫處理后的SF2-1和XQ10-1羊草種子中的表達進行PCR熒光定量分析。結(jié)果表明：變溫處理1 d后，在兩種材料中表達量都上調(diào)的基因有SAIN1，NAC2，EXPB4，EXPB16和EXPA2等5個。在萌發(fā)率高的SF2-1的材料中，還有11個基因分別有不同程度上調(diào)(圖3)，其中，EXPA2和PP2C72這兩個基因的上調(diào)明顯，分別較對照上調(diào)13.7和9.0倍。而在萌發(fā)率低的XQ10-1的材料中，僅有上述5個基因的表達量上調(diào)(圖4)。在兩個種質(zhì)中均上調(diào)表達的5個基因中，SAIN1基因在SF2-1中上調(diào)較XQ10-1明顯，而其他4個基因在XQ10-1中的上調(diào)更加明顯。

圖2 羊草種子萌發(fā)相關(guān)基因表達熱圖Fig.2 The heat map of expression of the genes related to germination in L. chinensis

圖3 SF2-1種子變溫處理后上調(diào)基因Fig.3 The up-regulated genes in SF2-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

各基因在變溫處理后的相對表達量均以其恒溫處理作為對照，因此各基因的相對表達量均以1作為對照。下同。The expression of the each genes under the variable temperature treatment were compared to the constant temperature control, therefore the expression level of the control groups is 1. The same below.

變溫處理1 d后，在SF2-1和XQ10-1中的表達量都下調(diào)的基因有Chi1，CBF3，5423和SAIN2。在SF2-1中，有8個基因的表達出現(xiàn)不同程度的下調(diào)(圖5)，SPATULA和Chi1基因下調(diào)均在5倍以上。在XQ10-1中，有6個基因出現(xiàn)不同程度的下調(diào)(圖6)，且與在SF2-1中的表達相比，Chi1、5423、CBF6、SAIN2在XQ10-1中的表達下調(diào)更加明顯。

圖5 SF2-1種子變溫處理后下調(diào)基因Fig.5 The down-regulated genes in SF2-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

圖6 XQ10-1種子變溫處理后下調(diào)基因Fig.6 The down-regulated genes in XQ10-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

通過基因表達的分析挑選高萌發(fā)率種質(zhì)SF2-1中表達差異顯著的11個基因，與低萌發(fā)率種質(zhì)XQ10-1中的表達量分別進行比較分析(如圖7，其中下調(diào)基因的表達量用負倒數(shù)表示)。結(jié)果表明，Chi1，CBF3，5423在兩個種質(zhì)中的表達均下調(diào)；而NAC2，EXPB4，EXPB16和EXPA2在兩個種質(zhì)中的表達均上調(diào)。

圖7 在SF2-1和XQ10-1中均特異表達的基因Fig.7 Genes specifically expressed in both of the seed genotypes SF2-1 and XQ10-1

依據(jù)各基因在不同溫度處理下萌發(fā)的種質(zhì)中表達的情況，以相對表達量上調(diào)或下調(diào)大于2倍為基準，篩選出9個相關(guān)基因，分別是Chi1、CBF3、5423、NAC2、GA3ox、EXPB4、EXPB16、SAIN1和EXPA2。對上述基因在高萌發(fā)率SF2-1種質(zhì)和低萌發(fā)率種質(zhì)XQ10-1中的表達量進行分析， 若基因在SF2-1中上調(diào)倍數(shù)大于XQ10-1或在SF2-1種質(zhì)中下調(diào)倍數(shù)小于XQ10-1，則表明該基因與種子萌發(fā)相關(guān)，進而明確各基因與變溫和萌發(fā)的相關(guān)程度(表2)。結(jié)果表明，這9個基因在變溫條件下均差異表達，表明這些基因均與變溫相關(guān)，而其中6個基因與高萌發(fā)率與低萌發(fā)率的兩個種質(zhì)均有關(guān)。因此，篩選得到變溫影響羊草種子萌發(fā)的6個關(guān)鍵基因：Chi1，CBF3，5423，GA3ox，EXPB4和SAIN1。

3 討論

種子萌發(fā)是一個復雜的生理生化過程，其中相關(guān)酶的活性、膜的通透性、膜結(jié)合蛋白的活力以及種子內(nèi)GA和ABA的合成代謝均受溫度影響。種子的萌發(fā)需要適宜的溫度。前人的研究表明，恒溫不利于羊草種子的萌發(fā)，低溫和變溫都能顯著提高種子萌發(fā)率。本課題組在對羊草種子萌發(fā)的前期研究表明，恒溫(16、20、22、28、37 ℃)處理下羊草中種子萌發(fā)率均較低(小于20%)，而在不同的變溫(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)條件下，羊草種子萌發(fā)率顯著升高。 在此基礎(chǔ)上， 系統(tǒng)地研究了變溫對羊草種子萌發(fā)的效應(yīng)，通過不同時段的變溫處理改變種子萌發(fā)的溫度條件，發(fā)現(xiàn)羊草種子萌發(fā)的第1天(第12～24 h)經(jīng)低溫處理可顯著提高種子萌發(fā)率，該時段(第12～24 h)可以說是羊草種子萌發(fā)中對響應(yīng)低溫信號的關(guān)鍵時段。

表2 與變溫或萌發(fā)相關(guān)的基因Table 2 The genes related to variable temperature treatment or germination

注：數(shù)字“1”代表相關(guān); “0”代表不相關(guān)。

Note: The number “1” stands for related; The number “0” stands for none-related.

細胞壁松弛素家族基因在變溫處理后的萌發(fā)期羊草種子中表達變化較普遍，上調(diào)較明顯。已有研究表明，在萌發(fā)中的擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子中，相比于在擬南芥中編碼細胞松弛蛋白的其他35個基因，EXPA2的表達量極高，并已證實了EXPA2是種子萌發(fā)所必需的，且EXPA2對萌發(fā)的作用受到GA的調(diào)控[29]。前人在番茄(Lycopersiconesculentum)的研究中發(fā)現(xiàn)，LeEXP4在胚乳的珠孔端特異表達，種子萌發(fā)過程中mRNA累積水平與胚乳珠孔端的軟化程度保持一致，通過軟化胚乳促進胚根的伸出，進而參與調(diào)控種子萌發(fā)[30-31]。本研究中的羊草種子變溫處理1 d后，EXPA2表達量上調(diào)了13.7倍，EXPB4和EXPB16在變溫處理后的表達也有明顯的上調(diào)，據(jù)此可以初步判斷細胞壁松弛素家族基因在羊草種子萌發(fā)中有重要作用。

植物激素參與對種子萌發(fā)的調(diào)控，其中，GA和ABA的作用較為關(guān)鍵。GA促進種子萌發(fā)。已有研究表明，擬南芥種子經(jīng)低溫處理后，AtGA3ox1及AtGA3ox2的表達量提高，參與GA的合成代謝[13]。羊草種子經(jīng)變溫處理后，GA3ox的表達量也明顯上調(diào)，可見羊草種子接受變溫信號后增強GA的合成，從而促進萌發(fā)。GA2氧化酶參與GA的分解代謝，我們發(fā)現(xiàn)羊草種子在變溫處理后其GA2ox的表達也表現(xiàn)為上調(diào)，這可能是種子萌發(fā)初期活躍的激素合成與代謝平衡的表現(xiàn)。GA3ox1和GA3ox2的轉(zhuǎn)錄受SPATULA抑制，SPATULA通過影響GA代謝而調(diào)控萌發(fā)，且受低溫層積下調(diào)表達[32]；發(fā)現(xiàn)羊草種子變溫處理后，SPATULA的表達下調(diào)，進而可能通過GA效應(yīng)作用于萌發(fā)。ABA維持種子休眠，抑制萌發(fā)。ABA在高等植物中的合成途徑中，ZEP可能起關(guān)鍵性作用[33]；本實驗中經(jīng)變溫處理后的羊草種子，ZEP基因的表達量上調(diào)，可能說明變溫萌發(fā)中ABA的效應(yīng)在一定程度上受到抑制。ABI8是ABA信號通路的一個重要調(diào)控因子，在擬南芥中有通過調(diào)節(jié)細胞纖維素合成影響細胞壁合成的功能[34]，在本研究中發(fā)現(xiàn)，羊草種子變溫處理后，ABI8的表達量有小幅的下調(diào)，可能表明在此過程中ABA含量降低或ABA效應(yīng)受阻，降低ABA對種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)。

植物中幾丁質(zhì)酶參與植物發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)，目前關(guān)于植物幾丁質(zhì)酶基因的研究主要集中在植物的抗病性[35]。Chi1在羊草種子萌發(fā)過程中可能由響應(yīng)低溫信號而表達下調(diào)，其在萌發(fā)中具體功能有待進一步研究。轉(zhuǎn)錄因子CBF基因包括CBF1、CBF2和CBF3，在植物冷適應(yīng)與植物抗冷抗凍性中有重要作用，已有研究表明CBF突變體表現(xiàn)出對低溫冷害的極度敏感[36]。在羊草種子接受低溫信號后，CBF3的表達明顯下調(diào)，與植物冷適應(yīng)過程相反，在此過程中可能由于CBF3表達的下調(diào)提升種子內(nèi)對低溫信號的響應(yīng)，從而使低溫進入種子萌發(fā)相關(guān)的信號通路，促進種子萌發(fā)。在羊草種子中，NAC2的表達在低溫誘導后的下調(diào)明顯；而NAC2在花生(Arachishypogaea)中參與ABA信號途徑，而且在擬南芥中過量表達NAC2可導致根生長及種子萌發(fā)對ABA過度敏感[37]。SAIN1和5423是在本研究組已有研究中發(fā)現(xiàn)的羊草新基因[38]，在羊草種子變溫萌發(fā)中的表達分析表明，SAIN1和5423可能與種子萌發(fā)有關(guān)，且可能受低溫誘導。

本研究在確定羊草種子響應(yīng)變溫的敏感期及關(guān)鍵時間點的基礎(chǔ)上， 探究羊草種子萌發(fā)過程中變溫響應(yīng)關(guān)鍵時期的基因表達變化，并初步篩選出可能與羊草種子萌發(fā)及變溫相關(guān)的關(guān)鍵基因，為深入研究種子萌發(fā)、變溫響應(yīng)相關(guān)基因的具體功能及種子萌發(fā)分子機理奠定了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

羊草種子萌發(fā)中的第一天是接受變溫信號的關(guān)鍵時期。本研究對前期羊草種子轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)深度分析，篩選與羊草種子萌發(fā)、休眠、低溫等相關(guān)基因24個，并對這些基因在變溫萌發(fā)過程中的表達進行分析，篩選出一些可能與變溫處理及種子萌發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵基因。由分析結(jié)果得到與變溫相關(guān)但與萌發(fā)無關(guān)的基因有轉(zhuǎn)錄因子基因NAC2和細胞松弛素編碼基因EXPB16、EXPA2；篩選得到6個與變溫處理和萌發(fā)均相關(guān)的基因，分別是幾丁質(zhì)酶基因Chi1、低溫響應(yīng)基因CBF3、赤霉素合成相關(guān)基因GA3ox、細胞松弛素編碼基因EXPB4和羊草新基因SAIN1、5423。