重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)大鼠脈絡(luò)膜新生血管的影響

李 偉 蘇銳鋒 付笑笑 楊 潔 張 壘 譚小波 蘇 暢(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北 承德 067000)

脈絡(luò)膜新生血管的病理特征為脈絡(luò)膜的新生血管長(zhǎng)入色素上皮下間隙或視網(wǎng)膜下引起滲出和出血，進(jìn)一步發(fā)展形成瘢痕影響視力，甚至致盲〔1〕。脈絡(luò)膜新生血管多見于黃斑部，影響視力，是致盲的主要原因之一。脈絡(luò)膜新生血管在成年人中常見，特別在60歲以上老年人群中更為常見〔2〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是脈絡(luò)膜新生血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抗VEGF 藥物治療在新生血管的治療中最有潛力〔3，4〕。Endostar是新研發(fā)的重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，具有抑制新生血管生長(zhǎng)的作用〔5，6〕。本文探討 Endostar對(duì)大鼠脈絡(luò)膜新生血管的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 24只健康、體重(220±20)g、挪威雄性大鼠，實(shí)驗(yàn)前雙眼均正常。Endostar(美國Gibco公司)，兔抗大鼠CD31單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美國Sigma公司)，Trizol總RNA提取試劑(美國Abcam公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 將24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(脈絡(luò)膜新生血管組)和Endostar組(脈絡(luò)膜新生血管+Endostar)，每組8只。

1.2.2 脈絡(luò)膜新生血管模型建立 將模型組和Endostar組大鼠10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉成功后，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，角膜麻醉采用愛爾凱因滴眼液，放置蓋玻片(滴加少量氧氟沙星眼用凝膠)接觸角膜，以視盤為中心，距離視盤2～3個(gè)視盤直徑處，采用氪激光均勻光凝9個(gè)點(diǎn)，如果有氣泡產(chǎn)生則表明Bruch膜被擊穿，證明光凝成功。

1.2.3 各組大鼠處理 脈絡(luò)膜新生血管形成后1 d，Endostar組大鼠玻璃體注射 5 mg/ml的 Endostar 10 μl，模型組和對(duì)照組大鼠玻璃體注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.4 眼底熒光造影檢查 脈絡(luò)膜新生血管建模后14 d進(jìn)行眼底熒光造影檢查。將大鼠麻醉后腹腔注射10%熒光素鈉(0.5 mg/kg)，熒光造影拍照觀察染料滲漏情況，評(píng)價(jià)脈絡(luò)膜新生血管形成情況。脈絡(luò)膜新生血管造模成功的標(biāo)志為造影晚期視盤周圍出現(xiàn)熒光素滲漏。16只大鼠均建模成功。滲漏率=滲漏點(diǎn)數(shù)/光凝點(diǎn)數(shù)。

1.2.5 脈絡(luò)膜新生血管面積測(cè)定 眼底熒光造影檢查結(jié)束后，麻藥過量處死三組大鼠，打開腹腔、夾閉腹主動(dòng)脈并剪開右心耳，左心室先灌注PBS 50 ml，再灌注異硫氰酸熒光素-右旋糖苷，摘除眼球，多聚甲醛固定，分離視網(wǎng)膜色素上皮層-脈絡(luò)膜-鞏膜并平鋪于玻璃片上，顯微鏡觀察脈絡(luò)膜新生血管形態(tài)，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量脈絡(luò)膜新生血管面積。

1.2.6 脈絡(luò)膜新生血管中央厚度測(cè)量 將大鼠眼杯在多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切成5 μm厚度切片，脫臘水化后進(jìn)行免疫熒光染色，以CD31為一抗，陰性對(duì)照組以PBS代替一抗，熒光顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量脈絡(luò)膜新生血管最大中央厚度。

1.2.7 VEGF、CXC趨化因子配體(CXCL)1和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α mRNA測(cè)定 提取大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體DNA，采用PCR測(cè)定VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA水平，PCR反應(yīng)條件:96℃ 4 min，然后94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共 42 個(gè)循環(huán)，以 GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白測(cè)定 提取大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體總蛋白，采用免疫印跡法測(cè)定VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平，其相對(duì)表達(dá)量以圖片的灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，兩組計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Endostar組和模型組脈絡(luò)膜新生血管面積、滲漏率比較 Endostar組脈絡(luò)膜新生血管面積、厚度、滲透率均明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1。

2.2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較 模型組VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA顯著低于模型組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 2。

表1 Endostar組和模型組脈絡(luò)膜新生血管面積、厚度、滲透率比較(，n=8)

表1 Endostar組和模型組脈絡(luò)膜新生血管面積、厚度、滲透率比較(，n=8)

組別 脈絡(luò)膜新生血管面積(pixel)脈絡(luò)膜新生血管厚度(μm)脈絡(luò)膜新生血管滲透率(%)Endostar組 50 324.12±2 647.57 73.24±18.69 48.79±13.24模型組 68 423.32±5 324.13 97.68±21.54 76.42±12.17 t值 10.435 3.657 3.283 P值 0.000 0.000 0.004

表2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較(，n=8)

表2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較(，n=8)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，與Endostar組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 VEGF mRNA CXCL1 mRNA HIF-1α mRNA對(duì)照組 0.10±0.01 1.25±0.26 0.13±0.04 Endostar組 0.12±0.03 1.42±0.31 0.16±0.04模型組 0.25±0.041)2) 2.78±0.451)2) 0.68±0.111)2)F值 83.217 50.326 352.574 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平比較模型組VEGF、CXCL1、HIF-1α水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α 水平顯著低于模型組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α水平和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比較(，n=8)

表3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比較(，n=8)

組別 VEGF CXCL1 HIF-1α對(duì)照組 0.63±0.12 1.21±0.23 0.58±0.09 Endostar組 0.71±0.14 1.28±0.26 0.66±0.11模型組 1.25±0.171)2) 3.02±0.371)2) 3.12±0.231)2)F值 53.246 69.426 287.363 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

新生血管性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)為微環(huán)境中抑制血管生成因子和促進(jìn)血管生成因子比例失調(diào)。VEGF是最重要的新生血管調(diào)控因子，不僅可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)新生血管網(wǎng)絡(luò)中的其他分子也具有調(diào)控作用。血小板源性生長(zhǎng)因子、血管生成素2、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促進(jìn)血管形成細(xì)胞因子在新生血管網(wǎng)絡(luò)中也發(fā)揮重要作用〔7，8〕。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對(duì)新生血管生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)VEGF等生長(zhǎng)因子與其相應(yīng)受體結(jié)合具有阻止作用;對(duì)金屬蛋白酶活性具有抑制作用，對(duì)其降解細(xì)胞外基質(zhì)具有阻斷作用，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞停滯在G1期及凋亡等，較VEGF抗體具有更廣泛的效應(yīng)〔9，10〕。Endostar作為新型的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，耐熱性和耐酸性能較高，半衰期較長(zhǎng)，生物活性增加，溶解度升高〔11～13〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Endostar具有抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的作用。

血管生成過程包括內(nèi)皮細(xì)胞和外膜細(xì)胞被激活、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、膜基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞分化、內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管成熟與穩(wěn)定。VEGF通過和內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，是血管生成最直接的刺激物，對(duì)血管生成的大多數(shù)環(huán)節(jié)具有調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移，血管管腔的形成，內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的溶解等〔14，15〕。CXCL1可由中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，屬于CXC家族成員之一，與其受體結(jié)合后參與血管生成反應(yīng)〔16〕。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子，對(duì)VEGF和其他相關(guān)分子具有調(diào)節(jié)作用，從而參與血管新生過程〔17，18〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Endostar對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用可能與Endostar降低VEGF、CXCL1、HIF-1α 表達(dá)有關(guān)。VEGF是新生血管的直接刺激物，其水平下降，使其對(duì)血管生成的刺激降低，內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移及血管管腔的形成下降;CXCL1、HIF-1α水平下降使其對(duì)血管形成的調(diào)節(jié)作用下降，從而對(duì)脈絡(luò)膜新生血管具有抑制作用。