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    有氧運動及膳食干預(yù)對胰島素抵抗大鼠心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ的影響

    2018-11-19 02:48:40吳菊花劉無逸廣西科技大學(xué)廣西柳州545006
    中國老年學(xué)雜志 2018年20期
    關(guān)鍵詞:高脂抵抗有氧

    吳菊花 劉無逸 (廣西科技大學(xué),廣西 柳州 545006)

    胰島素抵抗與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展緊密相聯(lián),可使機體產(chǎn)生心肌梗死、糖尿病性心肌病等疾病,其過程中易產(chǎn)生心肌脂質(zhì)代謝紊亂。有研究表明,心肌細胞脂質(zhì)代謝及能量代謝紊亂可能導(dǎo)致心肌產(chǎn)生多種疾病〔1,2〕。而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化酶活性、促進脂代謝、改善血脂及抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面作用顯著,尤其在脂代謝和糖代謝方面扮演重要角色,已引起眾多學(xué)者關(guān)注〔3,4〕。PPARγ是PPARs亞型之一,是脂肪細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一,可增加脂肪細胞數(shù)量,促進脂肪細胞三酰甘油合成,有效調(diào)劑脂質(zhì)代謝過程,經(jīng)激動劑激活后也可增強胰島素敏感性。本實驗旨在觀察有氧運動及膳食干預(yù)下,胰島素抵抗大鼠心肌PPARγ表達是否發(fā)生變化,進而確定有氧運動及膳食干預(yù)對胰島素抵抗大鼠心肌脂質(zhì)代謝是否產(chǎn)生影響。

    1 材料和方法

    1.1 實驗試劑及儀器 PPARγ抗體(SC-1984,美國Santa Cruz公司);山羊抗兔 IgG/辣根過氧化物酶(HRP)(碧云天生物技術(shù)研究所);β-actin(碧云天生物技術(shù)研究所);RIPA蛋白裂解液(P0013B,碧云天生物技術(shù)研究所);DSPT-202動物跑臺(杭州段氏制造);電泳儀(美國Hoefer公司);轉(zhuǎn)膜儀(北京百晶生物技術(shù)限公司)等。所有實驗儀器及實驗流程在上海體育學(xué)院運動健身科技省部共建教育部重點實驗室運動分子中心操作進行。

    1.2 實驗動物及分組 選用清潔級健康雄性SD大鼠215只,7周齡,體重206~257 g。大鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,批準號為〔準 SCXK(滬)2003-0002〕。清潔級飼養(yǎng)室:5只/籠進行分組,光照12 h,天黑前投食,自由飲水;環(huán)境溫度為22±2℃,相對濕度55.6%±4%。大鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,分為安靜對照組(CON)15只,胰島素抵抗模型組(MIR)200只。造膜成功后,MIR組分為高脂膳食安靜對照組(DIO)15只、高脂膳食運動組(DE)15只、正常膳食安靜對照組(NOR)15只、正常膳食運動組(NE)15只。CON組無任何干預(yù);DIO組僅繼續(xù)高脂喂養(yǎng);DE組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8 w,同時進行中等強度跑臺運動;NOR組改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);NE組改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 w,同時進行中等強度跑臺運動。

    1.3 模型建立及運動方案 基礎(chǔ)飼料:蛋白質(zhì)22.0%,脂肪5.2%,碳水化合物52.0%,其他20.8%。高脂飼料:在上述飼料基礎(chǔ)上,添加 10.0%豬油,15.0%蔗糖,0.2%膽固醇,0.2%蛋黃?;A(chǔ)飼料及高脂飼料由中國科學(xué)院上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

    1.3.1 MIR建立 CON和MIR組不限食量飼養(yǎng)。CON組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 w;MIR組高脂飼料喂養(yǎng)8 w,隨后進行口服糖耐量試驗:大鼠空腹12 h,眼眶靜脈取血以利舒坦血糖儀及試紙測即時空腹血糖(FBG),同時留取空腹靜脈血 0.5 ml。用 50%葡萄糖灌胃(2 g/kg)。于糖負荷后15、30、60和 120 min測即時血糖,并于每一時間點取血 0.5 ml,37℃ 靜置 10~20 min,3 000 r/min 離心 5min,分離血清,-20℃保存,待測,并根據(jù)公式,計算葡萄糖曲線下面積(AUCg)和胰島素曲線下面積(AUCi)。AUCg=1/2×(0 min+15 min)×0.25+1/2×(15 min+30 min)×0.25+1/2×(60 min+30 min)×0.5+1/2×(60 min+120 min)×1;AUCi=1/2×(0 min+15 min)×0.25+1/2×(15 min+30 min)×0.25+1/2×(60 min+30 min)×0.5+1/2×(60 min+120 min)×1。檢驗建模是否成功,測定FBG和空腹胰島素(FIN),并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。MIR組ISI顯著低于CON組,表明模型建立成功。ISI=In〔1/(FBS×FIN)〕〔5〕。胰島素為目前已知的唯一的降糖激素,其降糖作用發(fā)揮主要依賴于機體胰島素敏感性達到某一穩(wěn)定的平衡,血漿胰島素及其組織敏感性都與血糖呈負相關(guān),該公式可用于同一種群。模型建成后,將MIR組按體重排序,選取上游30%大鼠進行后續(xù)研究〔6〕。

    1.3.2 運動方案 開始時連續(xù)運動9 d,第1天跑速10 m/min,持續(xù)時間 20 min,以后隔日增加速度2 m/min,持續(xù)時間增加 10 min,第 9天起跑速達18 m/min,持續(xù)時間達60 min,跑臺坡度為5%,維持此強度,每周運動5 d,持續(xù)4 w;在第5~8周將跑速調(diào)節(jié)到 20 m/min,其余和前 4 w 相同〔7〕。

    1.4 取材及實驗方法 末次運動訓(xùn)練后,于第2天早晨用水合氯醛腹腔麻醉各組大鼠,取心臟,置于-80℃冰箱,冰凍處理。Western印跡半定量測定 PPARγ表達。

    1.5 Western印跡 取200 mg心肌,加入1 ml RIPA裂解液和蛋白酶及磷酸酶抑制劑,置于冰上,進行玻璃勻漿器研磨;4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清,保存于-20℃冰箱,待用。取適量蛋白與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(2×),1∶1混勻,沸水煮 6~8 min,冷卻后保存于-20℃。取蛋白樣品60 μg上樣,60 V電壓,在5%濃縮膠中濃縮約1.5 h;80 V電壓,在12%分離膠中分離約2.5 h;以120 V電壓轉(zhuǎn)膜約2 h。封閉:5%脫脂奶粉中4℃過夜。將NC膜置于一抗(PPARγ抗體:1∶500;β-actin:1∶1 000)中,4℃過夜;次日 TBST 洗滌 5×5 min,敷二抗(山羊抗兔IgG/HRP:1∶1 000)。室溫下?lián)u床2 h;電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光,暗室顯影,灰度分析。

    1.6 數(shù)據(jù)處理 Quantity One軟件讀取蛋白條帶的積分灰度值,Western印跡結(jié)果用目的蛋白積分灰度值與內(nèi)參蛋白積分灰度值的比值表示。GraphPad Prism 5進行數(shù)理統(tǒng)計及圖像生成,采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 胰島素抵抗大鼠建模成功 兩組葡萄糖吸收符合正常代謝過程,即均先升高然后逐漸下降。MIR組血糖上升幅度顯著高于CON組(P<0.05,P<0.01)。MIR組血漿胰島素濃度顯著高于CON組(P<0.01)。CON組與MIR組FBG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),F(xiàn)IN和ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明建模成功,見表 1,表 2。

    表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(,n=8)

    表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(,n=8)

    與 CON 組比較:1)P<0.05,2)P<0.01,同表 2

    組別 血糖(mmol/L)胰島素(μU/ml)0 min 15 min 30 min 60 min 120 min 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min CON 組 5.25±0.11 7.10±1.15 9.27±0.66 9.83±0.81 7.72±0.88 26.76±5.90 58.98±10.63 46.08±12.22 28.26±1.38 26.12±1.58 MIR 組 5.47±0.77 8.94±1.522) 10.48±0.792) 12.10±2.302) 10.36±2.801) 77.56±7.291)127.09±15.511)92.51±6.471) 87.71±8.851)60.74±10.461)

    表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(,n=8)

    表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(,n=8)

    組別 n FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI AUCg AUCi CON 組 15 5.25±0.15 26.76±6.69 -4.92±0.22 17.14±1.08 69.62±7.66 MIR 組 60 5.47±0.77 77.56±7.291) -6.04±0.191) 21.10±3.422) 172.31±9.132)

    2.2 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組大鼠體重的變 化 與CON組相比,NE組NOR組、DIO組和DE組體重均顯著升高(P<0.05)。與DIO組相比,從第2周干預(yù)起,NOR組和DE組體重均顯著降低(P<0.05);從第3周干預(yù)起,NE組顯著性低于DIO組(P<0.05)。見表3。

    表3 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后大鼠體重的變化(,g,n=8)

    表3 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后大鼠體重的變化(,g,n=8)

    與CON組比較:1)P<0.05;與DIO組比較:2)P<0.05;下表同

    組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周CON 組 484±28 496±25 504±23 508±24 512±23 515±22 519±22 522±23 NE 組 577±331) 579±321) 571±321)2) 565±301)2) 557±301)2) 552±291)2) 546±291)2) 540±32)NOR 組 575±231) 563±261)2) 558±271)2) 561±241)2) 564±241)2) 566±241)2) 568±271)2) 571±271)2)DIO 組 586±271) 609±221) 623±191) 637±161) 644±151) 653±151) 662±181) 670±171)DE 組 571±291) 574±291)2) 574±281)2) 570±281)2) 568±281)2) 566±261)2) 563±261)2) 561±231)2)

    2.3 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI比較 5組FBG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與CON組相比,DIO組FIN、ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與DIO組相比,DE組、NE組和NOR組FIN、ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

    表4 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI表達比較(,n=8)

    表4 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI表達比較(,n=8)

    組別 FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI CON 組 5.52±0.50 23.77±5.03 -4.85±0.17 DIO 組 6.06±1.07 131.60±22.881) -6.66±0.271)DE 組 5.62±0.33 41.45±16.402) -5.38±0.472)NOR組 5.54±0.59 29.86±9.722) -5.06±0.402)NE 組 5.56±0.50 35.85±5.222) -5.28±0.202)

    2.4 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組心臟重量(HW)和心臟重量指數(shù)(HW/BW)比較 NOR組HW明顯高于CON組(P<0.05);DIO組明顯高于DE組、NE組和NOR組(P<0.05),且顯著高于CON組(P<0.01)。NE組HW/BW顯著高于CON組(P<0.01),NOR組和NE組顯著高于DIO組(P<0.01)。見表5。

    2.5 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組心肌PPAR-γ比較 DE組和NE組心肌PPARγ表達量(0.87±0.09、0.88±0.09)顯著高于 CON 組(0.69±0.03,P<0.05),DIO組(0.53±0.07)顯著低于CON組(P<0.05);DE組和NE組顯著性高于DIO組(P<0.05)。NOR組為0.60±0.09。見圖 1。

    表5 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組大鼠HW和HW/BW的變化(,n=8)

    表5 8 w有氧運動及膳食干預(yù)后各組大鼠HW和HW/BW的變化(,n=8)

    與CON 組相比:1)P<0.05,2)P<0.01;與 DIO 組相比:3)P<0.05

    組別 HW(mg) HW/BW(mg/g)CON 1.24±0.08 2.5±0.183 DIO 1.53±0.231) 2.3±0.377 DE 1.24±0.103) 2.5±0.210 NOR 1.39±0.272)3) 2.8±0.7263)NE 1.28±0.123) 2.6±0.2262)3)

    3 討論

    圖1 心肌PPAR-γ Western印跡

    國外研究〔8,9〕表明,高脂飼料誘導(dǎo)所致的肥胖動物模型,符合人類肥胖-胰島素抵抗實際特征,因此本實驗選擇高脂飼料喂養(yǎng)進行胰島素抵抗模型構(gòu)造。

    誘發(fā)心臟功能障礙的一個重要因素是心肌胰島素抵抗,心肌胰島素抵抗重要特征之一即心肌細胞內(nèi)長鏈脂肪酸(LCFA)代謝持續(xù)儲積〔10〕,心肌脂代謝出現(xiàn)紊亂。PPARγ表達于心肌細胞中,可調(diào)控脂肪細胞分化基因表達,提高細胞質(zhì)脂解能力,增強脂肪酸向細胞運輸能力,影響細胞對胰島素敏感性,從而影響糖脂代謝,改善胰島素抵抗。Weismann等〔11〕通過敲除Trib3基因大鼠的胰島素抵抗模型,觀察PPARγ對大鼠胰島素敏感性調(diào)節(jié)狀況,發(fā)現(xiàn)大鼠的胰島素敏感性調(diào)節(jié)主要依靠PPARγ進行,由此可見,PPARγ與胰島素抵抗疾病的發(fā)生有重要關(guān)系。Sone等〔12〕以138名日本男性為研究對象,根據(jù)其是否具有習(xí)慣性運動,檢查其血脂變化,發(fā)現(xiàn)具有習(xí)慣性運動男性的血脂通過PPARγ調(diào)節(jié),其血脂具有顯著改善。

    適度有氧運動可降低體重,上調(diào)脂代謝,減輕胰島素抵抗。Marinho等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)任何強度有氧運動都可以有效增強小鼠胰島素敏感性。Fedewa等〔14〕對運動是否能夠改善青少年胰島素抵抗,進行Meta分析,結(jié)果表明小強度到中等強度的運動可以有效改善其胰島素抵抗狀況。一份2003~2004年度美國國民健康與營養(yǎng)調(diào)查報告〔15〕顯示,每天適量的身體運動可有效降低胰島素抵抗程度,對于改善血糖代謝,維持血糖穩(wěn)定而言,是一個重要的決定因素。Ruschke等〔16〕研究中,對153例患者進行為期4 w的加強性運動,發(fā)現(xiàn)患者的PPARγ與胰島素抵抗有相關(guān)性,且其 PPARγ mRNA表達量增加,有利于提高患者胰島素敏感性??傊?,胰島素抵抗患者保持適當(dāng)?shù)挠醒踹\動即可改善其胰島素抵抗癥狀。

    有氧運動除了可改善胰島素抵抗癥狀之外,也有學(xué)者從膳食方面對胰島素抵抗的改善進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)為期6個月的低脂飲食可以有效改善胰島素抵抗現(xiàn)象〔17〕。另外,胰島素抵抗的發(fā)生風(fēng)險與維生素D攝入量呈顯著負相關(guān)〔18〕,表明在胰島素抵抗患者的膳食攝入中應(yīng)增加維生素D的含量。同時,有研究發(fā)現(xiàn)增加不飽和脂肪酸和膳食纖維的攝入量,可以大幅度減少青少年日后胰島素抵抗疾病的發(fā)生〔19〕。

    由于有氧運動和膳食改變可改善胰島素抵抗狀態(tài),研究者將運動和飲食限制結(jié)合起來對具有胰島素抵抗的肥胖大鼠進行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合改善了大鼠肥胖所致的炎癥和胰島素抵抗所致的血管舒張〔20〕。但是關(guān)于兩者結(jié)合干預(yù)胰島素抵抗的研究并不多見,且對有氧運動、膳食改變和有氧運動結(jié)合膳食改變這三種干預(yù)胰島素抵抗的方式間并未有比較性的研究。本研究結(jié)果表明有氧運動結(jié)合膳食干預(yù)對于大鼠體重控制的效果最為明顯。FIN、ISI和PPARγ都有效反映了機體的糖脂代謝和胰島素抵抗程度。本研究發(fā)現(xiàn),有氧運動和膳食干預(yù)均有效地不同程度增加大鼠心肌PPARγ表達,減輕胰島素抵抗,而有氧運動與膳食干預(yù)相比,更有效地增加大鼠心肌PPARγ表達,改善了胰島素抵抗,而兩者疊加進行干預(yù),則效果更顯著。

    綜上,PPARγ在體內(nèi)糖脂代謝中作用復(fù)雜,有氧運動或(和)膳食干預(yù)如何影響PPARγ表達還需進一步研究。目前針對PPARγ如何改善胰島素抵抗中的脂質(zhì)代謝的機制仍存在一定爭議,仍需大量實驗研究證實。

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