中樞nesfatin-1表達下調(diào)對大鼠胰島素敏感性的影響

肖 蓉 令狐昌敏 唐 亮 熊 娜 郭耘菘 賈彥軍 周澤華(重慶市涪陵中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 408000)

nesfatin-1是一種新發(fā)現(xiàn)的下丘腦攝食抑制因子，由核組蛋白(NUCB)2N端水解產(chǎn)生〔1〕。研究表明，nesfatin-1不僅僅作為攝食調(diào)控因子在能量代謝方面起到作用，并且在胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用〔2～4〕。然而，中樞性 nesfatin-1調(diào)節(jié)胰島素敏感性及糖代謝的具體作用及分子機制尚不完全清楚。本研究擬利用已成功構(gòu)建的針對nesfatin-1的RNAi干擾腺病毒Ad-shNUCB2下調(diào)nesfatin-1基因表達，行第三腦室微量輸注，建立下丘腦 nesfatin-1低表達模型。通過3-3H葡萄糖和2-脫氧-3H葡萄糖(3H-2DG)為示蹤劑的擴展高胰島素正葡萄糖鉗夾技術(shù)評價中樞nesfatin-1下調(diào)對大鼠糖、脂代謝及胰島素敏感性的影響，旨在進一步探索中樞nesfatin-1在胰島素抵抗和糖尿病發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人工腦脊液購自BioPanda公司，每升里面包含氯化鈉6.279 g，氯化鉀0.216 g，氯化鈣0.353 g，氯化鎂 0.488 g，碳酸氫鈉 1.932 g，葡萄糖0.6 g，磷酸氫二鈉0.358 g，pH7.3～7.4;大鼠源性 nesfatin-1腺病毒高效率干擾重組載體(Ad-shNUCB2)由本研究組前期構(gòu)建，并且本研究組前期已經(jīng)證明Ad-shNUCB2具有非常高的抑制率，其有效序列:5'-GATCCCCGGTGGAAAGTGCAAGGATATTCAAGAGATA TCCTTGCACTTTCCACCTTTTTGGAAA-3';重組綠色熒光蛋白腺病毒載體(Ad-shGFP)作為空載對照病毒，由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)重點實驗室提供。

1.2 實驗動物 健康雄性4周齡SD大鼠60只，體重100～120 g，均購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院的野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，根據(jù)隨機表法完全隨機分為6組，分別為普食+人工腦脊液組(NCA組，n=10);普食+Ad-shGFP組(NCG組，n=10);普食喂養(yǎng)+Ad-shNUCB2組(NCN組，n=10);高脂喂養(yǎng)+人工腦脊液組(HFA組，n=10);高脂喂養(yǎng)+Ad-shGFP組(HFG組，n=10);高脂喂養(yǎng)+AdshNUCB2組(HFN組，n=10)。喂養(yǎng)10 w，普通飼料(熱卡百分比:脂肪7.39%，蛋白質(zhì)18.81%，碳水化合物51.96%，其他21.94%)，高脂飼料(熱卡百分比:脂肪26.98%，蛋白質(zhì)14.83%，碳水化合物40.97%，其他17.5%)。兩種飼料均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院的野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。

1.3 大鼠腦室內(nèi)微量給藥系統(tǒng)的建立 大鼠腦室內(nèi)微量給藥系統(tǒng)的建立操作方法均同本課題組前期研究〔5〕。大鼠禁食5 h后，測量其體質(zhì)量并氯安酮腹腔麻醉(87 mg/kg)備皮后，將其俯臥位頭部固定于大鼠腦立體定位儀，常規(guī)皮膚消毒，沿顱頂中線皮膚切開，暴顱骨及前囟，參照腦立體定位圖譜定位第三腦室〔5〕，利用螺絲釘及玻璃離子水門汀固定套管并縫合皮膚。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，并預(yù)防性使用青霉素。第三腦室置管術(shù)后第5天，套管內(nèi)輸注血管緊張素Ⅱ10 ng(10 ng稀釋到10 μl生理鹽水中)，監(jiān)測大鼠飲水量，15 min飲水＜5 ml者予以剔除。

1.4 擴展高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù) 鉗夾術(shù)前2 d，空白對照組(NCA和HFA組)每只大鼠第三腦室內(nèi)輸注人工腦脊液10 μl，陰性對照組(NCG和 HFG組)輸注 Ad-shGFP(109PFU/只)，干預(yù)組(NCN和HFN組)輸注大鼠nesfaitn-1干擾重組腺病毒載體AdshNUCB2(109PFU/只)。擴展鉗夾術(shù)操作同前〔6〕:鉗夾開始前1 h(0 min)由動脈導(dǎo)管給予3-〔3H〕標記葡萄糖6 μCi，隨后以0.2 μCi/min的速度輸注直至鉗夾結(jié)束。t=120 min 時開始鉗夾，以 6 mU·kg－1·min－1的速度輸注胰島素及25%葡萄糖溶液，根據(jù)血糖調(diào)整葡萄糖輸注率(GIR)，使血糖維持在 4.5～5.5 mmol/L。于鉗夾 0、60、140、160、170、180 min分別取血液樣品分離血漿，置于－80℃用于測定代謝指標。1.5 攝食測定 在普食喂養(yǎng)及高脂喂養(yǎng)的大鼠第三腦室分別注入人工腦脊液(10 μl/只)、Ad-shGFP(109PFU/只)、Ad-shNUCB2(109PFU/只)后，每隔24 h連續(xù)7 d檢測大鼠攝食量及體重變化。

1.6 組織葡萄糖攝取率測定 在鉗夾術(shù)的基礎(chǔ)上，通過課題組已經(jīng)建立的方法采用3H-2DG(Amersham公司)作為示蹤劑測定各組織葡萄糖攝取率(GU)〔5〕。鉗夾結(jié)束前45 min，由靜脈導(dǎo)管注入3H-2DG 30 μCi，并于注入3H-2DG 后的 2、5、10、15、20、30 min 和45 min 7個時間點留取血液標本，并記錄各點血糖濃度。實驗結(jié)束后，立即處死大鼠，快速剝離附睪脂肪、棕色脂肪、比目魚肌和腓腸肌組織，置于生理鹽水洗滌3次，濾紙吸盡水分，立即置于液氮;檢測前于液氮中快速取出組織，稱取約100 mg組織，置于0.2 mmol/L NaOH中孵育裂解，0.4 mol/L HCl中和后，加入閃爍杯，室溫過夜，LS6500液閃儀檢測每分鐘衰變率。

1.7 各項參數(shù)計算 根據(jù)Steel公式〔7〕計算葡萄糖利用率:即在鉗夾穩(wěn)態(tài)時，外源性葡萄糖的輸注率(GIR)反映了整個機體對胰島素的敏感性。機體對葡萄糖利用率等于葡萄糖清除率(GRd)，GRd=〔3H〕標記GIR(dpm/min)/血漿〔3H〕標記葡萄糖比活性(dpm/mg);肝糖生成(HGP)=GRd-GIR;基礎(chǔ)狀態(tài)下HGP=GRd。

1.8 血漿生化指標測定 血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;血漿胰島素采用放射免疫法測定(美國Linco公司);血漿三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均用酶法測定;血漿3-〔3H〕葡萄糖比活性、3H-2DG血漿及組織比活性均采用液體閃爍計數(shù)法測定(美國Amersham公司產(chǎn)品)。

1.9 腦組織nesfatin-1 mRNA水平測定 在普食喂養(yǎng)及高脂喂養(yǎng)的大鼠第三腦室分別注入人工腦脊液(10 μl/只)、Ad-shGFP(109PFU/只)、Ad-shNUCB2(109PFU/只)，7 d后，留取各組大鼠中樞組織，利用Trizol提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，采用SYBR GreenⅡ熒光染料(Takara公司，日本)通過實時熒光定量PCR法檢測腦組織nesfatin-1 mRNA表達水平。結(jié)果以 Ct值表示，以 β-actin基因作為內(nèi)參，用 2－△△Ct計算腦組織目的基因nesfatin-1 mRNA相對表達水平。其中引物序列如下:nesfatin-1:上游引物:5'-TTTGAACACCTGAACCACCA-3';下游引物:5'-TGCAAACTTG GCTTCTTCCT-3';β-actin上游引物:5'-CCCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAAA-3';下游引物:5'-TCTCCG GAGTCCATCACAATGCCTGTG-3'。

1.10 免疫組化檢測腦組織nesfatin-1蛋白水平 4%多聚甲醛固定、石蠟包埋的大鼠腦組織進行切片、脫蠟，3%過氧化氫孵育 15 min，5%胎牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉25 min，兔抗大鼠nesfatin-1單克隆抗體(Abcam，英國)4℃孵育過夜，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕緩洗滌3次，進行辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，之后按照說明說進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件包進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠基礎(chǔ)生化指標及攝食比較 大鼠禁食12 h后，NCA組、NCG組和 NCN組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIns)、FFA、TG、TC、LDL-C 及HDL-C無顯著差異，同樣，以上所測指標在HFA組、HFG組和HFN組間也無顯著差異(均P＞0.05)。而與NCA組相比，HFA組、HFG組及HFN組FIns、FFA、TG、TC及LDL-C顯著增加(均P＜0.05)，HDL-C顯著降低(均P＜0.05)。FBG在各組間均無顯著性差異(表1)。與NCA組相比，中樞輸注Ad-shNUCB2能夠顯著抑制大鼠腦組織nesfatin-1的mRNA及蛋白表達(圖1，表2);此外，在普食喂養(yǎng)下或者高脂喂養(yǎng)下，中樞輸注Ad-shNUCB2能夠顯著增加大鼠攝食，于第3天達至高峰;然而，體重變化無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。

圖1 各組腦組織不同區(qū)域nesfatin-1蛋白表達(DAB，×100)

表1 各組大鼠基礎(chǔ)生化指標比較(，n=10)

表1 各組大鼠基礎(chǔ)生化指標比較(，n=10)

與NCA組比較:1)P＜0.01，下表同

組別 FBG(mmol/L) FIns(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) FFA(mmol/L)NCA 組 5.56±0.16 21.71±0.52 0.38±0.01 1.44±0.03 0.93±0.02 0.60±0.17 0.73±0.02 NCG 組 5.36±0.19 22.21±0.98 0.38±0.03 1.61±0.08 0.89±0.04 0.62±0.03 0.69±0.03 NCN 組 5.21±0.16 22.20±1.83 0.38±0.03 1.63±0.08 0.92±0.05 0.59±0.03 0.70±0.05 HFA 組 5.66±0.15 25.80±1.011) 0.95±0.051) 2.03±0.111) 0.72±0.051) 0.87±0.061) 1.82±0.121)HFG 組 5.40±0.17 25.55±0.751) 1.01±0.121) 2.01±0.101) 0.73±0.061) 0.83±0.071) 1.59±0.181)HFN 組 5.42±0.12 26.95±1.831) 1.00±0.091) 1.92±0.101) 0.77±0.051) 0.95±0.061) 1.68±0.111)

表2 各組中樞輸注Ad-shNUCB2后nesfatin-1 mRNA、體重和攝食比較(，n=10)

表2 各組中樞輸注Ad-shNUCB2后nesfatin-1 mRNA、體重和攝食比較(，n=10)

組別 nesfatin-1 mRNA 體重(g) D1(g/d) D3(g/d) D5(g/d) D7(g/d)NCA 組 1．000±0．093 26．57±2．19 67．41±7．29 80．97±4．68 78．17±4．32 75．30±4．49 NCG 組 0．097±0．080 26．10±0．83 69．8±6．84 69．33±2．39 70．21±2．51 69．57±3．51 NCN 組 0．660±0．0701) 27．23±3．00 70．00±4．94 69．10±5．10 69．86±3．71 69．10±2．37 HFA 組 0．630±0．0821) 38．00±2．371) 80．08±3．971) 83．54±4．751) 82．29±5．121) 81．50±3．541)HFG 組 0．640±0．0791) 36．73±2．071) 80．55±3．011) 80．95±4．621) 84．80±6．201) 81．03±2．041)HFN 組 0．390±0．6201) 38．73±1．361) 84．84±5．711) 93．37±3．921) 88．11±2．381) 87．56±1．971)

2.2 正葡萄糖高胰島素鉗夾術(shù)中各生化指標的變化

鉗夾穩(wěn)態(tài)期，各組FBG均維持在4.5～5.5 mmol/L。外源性給予同樣的胰島素輸注率，血漿FIns升高到基礎(chǔ)值的4～6倍。與NCA組相比，HFA組、HFG組和HFN組血漿FIns水平顯著增高(P＜0.01)，而NCA、NCG和NCN組之間，HFA組、HFG組及HFN組之間血漿FIns水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)。鉗夾穩(wěn)態(tài)中，各組 TG、TC、FFA、LDL-C水平均受到明顯抑制(P＜0.01)。但HFA組、HFG組及HFN組上述指標仍顯著高于NCA組(均P＜0.01)，而NCA和NCN組之間，HFA組、HFG組及HFN組之間血脂水平?jīng)]有顯著差異(均 P＞0.05)，見表 3。

表3 高胰島素鉗夾術(shù)穩(wěn)態(tài)期各組大鼠生化指標比較(，n=10)

表3 高胰島素鉗夾術(shù)穩(wěn)態(tài)期各組大鼠生化指標比較(，n=10)

組別 FBG(mmol/L) FIns(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) FFA(mmol/L)NCA 組 5.27±0.94 99.03±0.64 0.16±0.01 1.16±0.12 0.95±0.01 0.56±0.01 0.21±0.01 NCG 組 5.15±0.14 95.51±5.97 0.20±0.02 1.24±0.04 0.95±0.05 0.54±0.03 0.21±0.01 NCN 組 5.30±0.20 97.39±2.92 0.20±0.02 1.21±0.04 0.97±0.04 0.52±0.03 0.25±0.02 HFA 組 5.17±0.10 122.12±6.971) 0.68±0.061) 1.60±0.101) 0.76±0.021) 0.83±0.061) 0.69±0.081)HFG 組 5.04±0.11 123.55±13.831) 0.73±0.111) 1.61±0.111) 0.76±0.031) 0.70±0.051) 0.68±0.091)HFN 組 5.08±0.10 123.64±6.381) 0.68±0.061) 1.57±0.091) 0.82±0.041) 0.75±0.041) 0.68±0.041)

2.3 穩(wěn)態(tài)時糖代謝各指標比較 鉗夾穩(wěn)態(tài)時，與NCA組相比，HFA組 GIR及 GRd明顯下降(P＜0.05)，與NCA、NCG組分別相比，NCN 組GIR、GRd明顯下降(均P＜0.05);同樣與HFA、HFG組分別相比，HFN組 GIR、GRd顯著下降(均 P＜0.05)。AdshNUCB2中樞干預(yù)顯著增加大鼠肝糖生成(HGP)，與NCA、NCG組分別相比，NCN組HGP明顯升高(均P＜0.05);同樣，與HFA、HFG組分別相比，HFN組 HGP增高(均P＜0.05)。在鉗夾穩(wěn)態(tài)時，與NCA或NCG組相比，NCN組HGP抑制率明顯降低;與HFA、HFG組分別相比，HFN組HGP抑制率也明顯下降(均P＜0.05)，見表 4。

表4 鉗夾穩(wěn)態(tài)時各組胰島素敏感性指標比較(，n=10)

表4 鉗夾穩(wěn)態(tài)時各組胰島素敏感性指標比較(，n=10)

與 NCA 組比較:1)P＜0．01;與 NCG 組比較:2)P＜0．01;與 HFG 組比較:3)P＜0．01;與 HFG 組比較:4)P＜0．01;與 NCN 組比較:5)P＜0．01; 下表同

組別 葡萄糖輸注率(mg·kg－1·min－1)葡萄糖清除率(mmol·kg－1·min－1) 肝糖生成量(mg·kg－1·min－1) 肝糖生成抑制率(%)NCA 組 23．53±1．95 0．175 6±0．003 2 8．08±2．84 0．41±0．09 NCG 組 22．09±1．23 0．177 2±0．005 4 9．80±1．35 0．37±0．07 NCN 組 17．18±0．961)2) 0．163 5±0．002 31)2) 12．25±1．231)2) 0．25±0．021)2)HFA 組 10．04±1．761) 0．139 0±0．002 81) 14．52±2．101) 0．28±0．051)HFG 組 10．16±1．782) 0．138 0±0．002 52) 14．69±0．932) 0．28±0．062)HFN 組 5．96±0．633)4)5) 0．127 0±0．002 23)4)5) 16．94±1．213)4)5) 0．20±0．043)4)5)

2.4 各組織葡萄糖攝取率比較 經(jīng)10 w高脂喂養(yǎng)后，HFA組附睪脂肪、棕色脂肪、比目魚肌和腓腸肌的GU均顯著低于NCA組(均P＜0.05)。而中樞nesfatin-1表達下調(diào)能顯著降低大鼠肌肉及脂肪組織GU，與NCA、NCG組分別相比，NCN組附睪脂肪組織、棕色脂肪組織、比目魚肌和腓腸肌GU均顯著降低(均P＜0.05);同樣，與HFA、HFG組分別相比，HFA組各組織中GU均明顯降低(均P＜0.05)。見表5。

表5 各組葡萄糖攝取率比較(，n=10，%)

表5 各組葡萄糖攝取率比較(，n=10，%)

組別 腓腸肌 比目魚肌 棕色脂肪 白色脂肪NCA 1．34±0．38 3．43±0．69 7．32±0．91 0．40±0．06 NCG 1．18±0．41 3．52±0．70 7．35±1．05 0．39±0．06 NCN 0．77±0．151)2) 1．98±0．361)2) 5．21±0．461)2) 0．30±0．031)2)HFA 0．47±0．11) 1．39±0．261) 3．43±0．501) 0．19±0．031)HFG 0．48±0．112) 1．33±0．212) 3．45±0．382) 0．19±0．022)HFN 0．34±0．033)4)5)0．87±0．123)4)5)2．40±0．373)4)5)0．14±0．033)4)5)

3 討論

nesfatin-1是新發(fā)現(xiàn)由NUCB2 N端水解產(chǎn)生的82個氨基酸所組成的肽段，分子量為9.7×103。NUCB2由一組高度保守的蛋白質(zhì)組成，包括24個氨基酸組成的氨基末端信號肽和396個氨基酸序列〔1〕。nesfatin-1廣泛分布于下丘腦、胰島β細胞、脂肪組織等〔8〕。下丘腦作為生命活動的中樞。下丘腦的一系列核團，例如室旁核、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、視上核等形成復(fù)雜和相互影響的網(wǎng)絡(luò)，分泌相關(guān)細胞因子和蛋白調(diào)節(jié)營養(yǎng)攝入及能量代謝〔9，10〕。然而，作為中樞作用因子，中樞nesfatin-1調(diào)節(jié)機體胰島素敏感性及葡萄糖代謝的具體機制尚不完全清楚。本研究首次證實中樞nesfatin-1表達抑制能夠明顯抑制外周組織對機體葡萄糖的攝取與利用，促進肝糖產(chǎn)生，加重機體胰島素抵抗程度。

研究顯示，大鼠第三腦室、第四腦室內(nèi)輸注nesfatin-1可抑制大鼠夜間攝食行為，而長期輸注nesfatin-1可導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量下降，尤其是脂肪組織明顯減少〔1，3，11，12〕。與正常人群相比，2 型糖尿病患者及糖調(diào)節(jié)受損者空腹血漿nesfatin-1水平顯著降低，表明nesfatin-1可能與胰島素敏感性及糖代謝有關(guān)〔13〕。本課題組前期通過向高脂大鼠第三腦室內(nèi)短期輸注nesfatin-1重組蛋白，研究發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟糖異生明顯被抑制，同時肝臟胰島素敏感性顯著提高〔4〕，此外中樞nesfatin-1表達下調(diào)能夠明顯促進肝糖異生調(diào)控基因表達，抑制機體胰島素作用信號通路〔14〕，然而，對于中樞nesfatin-1表達下調(diào)對機體肝糖產(chǎn)生及系統(tǒng)胰島素敏感性的影響尚未有報道。

本研究提示高脂喂養(yǎng)大鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂，擴展胰島素鉗夾術(shù)中發(fā)現(xiàn)，在相同的外源胰島素輸注下，為維持穩(wěn)定的血糖水平，機體外源性葡萄糖的需要量明顯減少，即機體胰島素的敏感性降低;且胰島素對肝糖的抑制作用顯著降低，說明肝胰島素敏感性同樣降低，中樞nesfatin-1低表達顯著降低機體外周組織葡萄糖攝取率。這些結(jié)果充分說明，中樞nesfatin-1表達下調(diào)能同時降低肝和外周組織胰島素敏感性。然而，長期的中樞nesfatin-1信號改變對機體胰島素敏感性的影響尚需進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦室內(nèi)長期輸注nesfatin-1，能夠在減少夜間攝食行為的同時降低大鼠體質(zhì)量，并導(dǎo)致機體脂肪含量減少〔1〕，本研究結(jié)果與文獻報道一致，向SD大鼠腦室內(nèi)輸注Ad-shNUCB2后，中樞nesfatin-1表達下調(diào)能夠增加攝食，然而，大鼠體重沒有明顯變化，這可能與本研究干預(yù)時間較短相關(guān)。FFA、TG、TC、LDL-C及HDL-C與對照組相比無顯著差異，提示短期下丘腦nesfatin-1表達下調(diào)對脂代謝影響不大。然而，nesfatin-1是否對脂代謝產(chǎn)生影響仍需進一步研究。