組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2對乙型肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌進(jìn)展的影響

王玉萍 張 娟 (河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450002)

肝細(xì)胞癌(HCC)常見的致病因素包括多種病因所致的肝硬化、慢性乙型、丙型肝炎病毒的感染、酗酒、代謝紊亂等，其中在亞洲人群內(nèi)慢性乙型肝炎病毒感染及其相關(guān)的肝硬化是最常見的HCC的致病因素〔1～3〕。盡管對乙型肝炎病毒(HBV)的致病機(jī)制的相關(guān)研究一直在進(jìn)行中，但患者最終的生存預(yù)后至今仍無顯著改善，具體表現(xiàn)為早期診斷較差及有效治療干預(yù)措施缺乏等〔4〕。HCC目前臨床上最常應(yīng)用的血清標(biāo)志物為甲胎蛋白(AFP)，但研究顯示將近40%的HCC患者AFP無顯著升高，并且部分AFP顯著升高的患者僅存在肝硬化或HBV感染的活動(dòng)期，因此尋求一種新型的標(biāo)志物以提高早期檢測HCC的準(zhǔn)確性，有利于后期患者治療的預(yù)后改善是十分有必要的。最新的研究嘗試使用cDNA微陣列分析探索基因表達(dá)因素與腫瘤侵襲性之間的相關(guān)關(guān)系，其具有準(zhǔn)確性高、針對性強(qiáng)等優(yōu)勢，同時(shí)有研究通過肝癌細(xì)胞蛋白定量分析顯示組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGM)2具有作為新型組織/血清早期檢測HCC標(biāo)志物的潛能〔5～7〕，因此本研究中我們使用微陣列分析及免疫組化染色對乙型肝炎相關(guān)性HCC的進(jìn)展與TGM2表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行初步探討，以對臨床診治及相關(guān)研究有所指導(dǎo)及借鑒意義。

1 資料與方法

1.1 患者資料 本研究共納入120例乙型肝炎相關(guān)性HCC患者，根據(jù)TNM分期研究人群分為Ⅰ～Ⅳ期，每期病例數(shù)均為30例。通過標(biāo)準(zhǔn)肝臟穿刺方法獲取組織標(biāo)本，操作均經(jīng)我院倫理委員會(huì)及患者本人知情同意。

1.2 細(xì)胞系 研究中選擇使用人肝癌細(xì)胞株HepG2，由于其承載了完整的HBV基因組，并且能夠生成所有的病毒相關(guān)蛋白、HBV DNA及Dane顆粒;自中科院細(xì)胞研究所獲得BEL7402肝癌細(xì)胞系，細(xì)胞均培養(yǎng)于含有高葡萄糖改良Eagle氏培養(yǎng)基內(nèi)(HyClone)，添加10%胎牛血清(Gibco)，37℃，5%CO2。

1.3 方法 取20例HCC組織進(jìn)行微陳列分析基因表達(dá)譜。為了驗(yàn)證TGM2差異性表達(dá)的顯著性，我們對組織標(biāo)本使用TGM2抗體進(jìn)行免疫組化染色，若TGM2免疫檢測陽性的細(xì)胞超過50%，則定義為TGM2大量表達(dá)，初步假設(shè)TGM2抑制劑可能作為治療的靶方向，使用5、10、15、20 nmol/L 胱胺作用于 HCC 48 h的腫瘤細(xì)胞，觀察HCC的細(xì)胞存活率。

1.4 微陣列分析 使用RNA提取試劑盒自原代細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)提取RNA，并對其質(zhì)量及完整性進(jìn)行檢驗(yàn);使用Affymetrix公司的U133加2.0陣列表達(dá)譜進(jìn)行分析。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行cDNA的合成、探針標(biāo)記、雜交及陣列掃描，按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法進(jìn)行基本微陣列數(shù)據(jù)的可視化及數(shù)據(jù)過濾〔8〕。使用dCHIP程序進(jìn)行組間的陣列數(shù)據(jù)分析比較，建立樣本分組，使用中強(qiáng)度探針對變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并作為陣列參數(shù)的基準(zhǔn)水平，基于模型的表達(dá)通過完美匹配/不匹配差分模型進(jìn)行計(jì)算分析。

1.5 免疫組化染色分析 組織標(biāo)本或細(xì)胞使用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行固定，之后進(jìn)行石蠟包埋并按照標(biāo)準(zhǔn)方法步驟進(jìn)行染色，簡要言之首先使用二甲苯去除石蠟，后對標(biāo)本進(jìn)行不同濃度乙醇的脫水，然后使用2%山羊血清進(jìn)行封閉。隨后樣本與一抗進(jìn)行過夜孵育(4℃)，室溫下二抗與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合1 h，通過HRP底物實(shí)現(xiàn)信號強(qiáng)弱的可視化。一抗包括:多克隆兔抗GFAP(Chemicon International公司)、單克隆鼠抗 EMA(Thermo Scientific)、多克隆兔抗S100和單克隆小鼠抗波形蛋白(Dako公司);TGM2抗體購自Abcam公司;對腫瘤區(qū)域至少隨機(jī)選擇4個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域(HPF)進(jìn)行分析，研究者獨(dú)立對HPF的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄為%/HPF。

1.6 Western印跡分析 收集腫瘤細(xì)胞后使用低溫PBS洗滌2次，后使用RIPA緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，獲得的細(xì)胞裂解物首先于冰上靜置 30 min，后13 000 r/min離心10 min后再次將沉淀懸浮于含有十二烷基硫酸鈉(SDS)及33%甘油的緩沖液內(nèi)，獲得的蛋白質(zhì)通過SDS-聚偏氟乙烯(PVDF)進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(Bio-Rad公司)利用適宜的抗體、HRP結(jié)合的二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(GE，費(fèi)爾菲爾德)進(jìn)行Western印跡分析。最后通過GS-800校準(zhǔn)密度儀(BioRad公司)對相對表達(dá)水平進(jìn)行定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)圖譜 用于微陣列分析的總計(jì)20例組織樣本，多變量分析聚類產(chǎn)生的熱圖顯示存在2 552個(gè)轉(zhuǎn)錄的差異性表達(dá);而后通過MATLAB版本(R2013a)使用“＇mafdr＇”指令來計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)用于Ⅰ期與Ⅳ期HCC的多重比較檢驗(yàn)假設(shè)，結(jié)果顯示與Ⅰ期相比，Ⅳ期時(shí)TGM2的基因表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 Ⅰ期與Ⅳ期HCC基因表達(dá)微陣列分析

2.2 HCC內(nèi)TGM2的表達(dá) TGM2的大量表達(dá)主要見于Ⅲ期(79.8%)及Ⅳ期(91.2%)HCC，顯著高于Ⅰ(23.5%)～Ⅱ期(43.8%)腫瘤組織內(nèi)的水平(P＜0.05)，提示TGM2的表達(dá)可能與腫瘤的侵襲性及病情進(jìn)展相關(guān)。

2.3 抑制TGM2促進(jìn)細(xì)胞死亡 在使用胱胺后48 h后，腫瘤細(xì)胞的存活率下降(5，10，15，20 nmol/L 胱胺組存活率分別為63.4%，51.3%，45.6%，36.5%)至最大值的36.5%左右。

3 討論

HBV相關(guān)的慢性肝臟病變是HCC的最主要病因之一，據(jù)報(bào)道若無干預(yù)措施其發(fā)展成肝硬化的概率可達(dá)40%左右，極大地增加了罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)。此類患者的預(yù)后很大程度上與早期的診斷及后期的有效治療措施密切相關(guān)〔9〕。

TGM2作為多功能酶能夠?qū)D(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，形成谷氨酰胺和賴氨酸側(cè)鏈分子間的異肽鍵，其參與不同的生物作用過程，有研究顯示其在乳糜瀉、神經(jīng)變性疾患及部分癌癥等中發(fā)揮重要作用〔10，11〕。最新的研究亦證實(shí)TGM2的表達(dá)水平上調(diào)與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞型肺癌、喉癌等癌癥的預(yù)后差相關(guān)，并且有研究認(rèn)為其可作為乳腺癌或肺癌化療抵抗的有效標(biāo)志物，對于腦部神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者TGM2的表達(dá)上調(diào)顯著減少患者的生存期〔12〕;而若使用胱胺、葡糖胺或KCC009對TGM2進(jìn)行抑制則能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌或胰腺癌的細(xì)胞死亡，同時(shí)研究顯示TGM2的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的侵襲性較強(qiáng)相關(guān)，因此其可作為治療部分類型癌癥的作用靶點(diǎn)〔13～17〕。

TGM2在諸多組織內(nèi)可大量表達(dá)，并且可存在于細(xì)胞的多個(gè)區(qū)域，包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體及細(xì)胞核內(nèi)，其在細(xì)胞生長、分化及凋亡中通過多種作用機(jī)制施加負(fù)面作用，具體包括轉(zhuǎn)酰氨基酶、GTP酶、細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、激酶和蛋白質(zhì)折疊等〔18〕。TGM2在腫瘤形成中的具體作用機(jī)制目前仍不清楚，但相應(yīng)的存在幾種機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為TGM2可以激活核因子(NF)-κB、局部的黏連激酶(FAK)酪氨酸激酶，進(jìn)而激活抗細(xì)胞凋亡通路，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的永生化〔19〕。若使用 TGM2的抑制劑KCC009可使Akt磷酸化下降而促凋亡蛋白Bim的表達(dá)上調(diào)，從而使腫瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞凋亡過程顯著增強(qiáng)〔20，21〕。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)在HBV相關(guān)的HCC組織中TGM2的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性及分期相關(guān)，通過競爭抑制TGM2的作用通路可促使腫瘤細(xì)胞凋亡。