支鏈siRNA多靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡作用的影響

周 悅 莫 黎 王 辛 周慶偉 (南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 20029)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一〔1〕。近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年攀升。上海、北京、天津及沿海地區(qū)為高發(fā)區(qū)，流行趨勢(shì)明顯改變?yōu)槌鞘懈哂谵r(nóng)村，沿海地區(qū)高于內(nèi)地，乳腺癌嚴(yán)重影響了患者的生活及生存質(zhì)量。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新藥研究尤為重要〔2〕。隨著對(duì)乳腺癌研究的深入，研究者們對(duì)傳統(tǒng)的治療，如手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療療效重新審視，目前尚無(wú)有效的治療手段。因此尋找新的乳腺癌治療策略尤為必要。近年來(lái)，以小干擾RNA(siRNA)為基礎(chǔ)的干擾(RNAi)技術(shù)發(fā)展迅速，其以低毒、特異和高效等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越廣泛受到研究者的關(guān)注并取得了顯著進(jìn)展〔3〕。為此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了支鏈siRNA多靶點(diǎn)抑制劑作用于乳腺癌4T1細(xì)胞，分析并探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 乳腺癌4T1細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;MTT由美國(guó)Sigma生產(chǎn);Lipofectamine2000試劑OPTI-MEM(1X)均由美國(guó)生產(chǎn);標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清由天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 序列合成 RNA oligo合成由上海GenePharma公司提供。

1.3 主要儀器 倒置光學(xué)顯微鏡(日本NiKon ECLIPSE 80i);二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社制造);酶標(biāo)儀(中國(guó)北京普朗新有限公司);熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀(日本Olympus Tokyo)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 分為正常對(duì)照組﹑陰性對(duì)照組(0.003 μg/μl)、siRNA-STAT3 組 (0.066 μg/μl) ﹑siRNA-STAT6 組 (0.066 μg/μl) ﹑ siRNA-STAT5a(0.066 μg/μl)組及 siRNA-STAT5b(0.066 μg/μl)組;Mixture組(0.26 μg/μl)由4種基因序列混合液配制;各實(shí)驗(yàn)組均按GenePharma公司說(shuō)明書配置操作。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明書完成。每實(shí)驗(yàn)組乳腺癌4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，棄掉培養(yǎng)液，各組均按實(shí)驗(yàn)要求檢測(cè)各種指標(biāo)。

1.5 MTT法檢測(cè)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液為2×104/ml，接種至96孔板，每孔 100 μl，每組設(shè) 4個(gè)復(fù)孔，置入 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后，各組分別在24 h、48 h及72 h檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入MTT溶液20 μl，置入培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DSMO，振蕩器震蕩10 min。采用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組吸光值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 500 r/min，離心 5 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，接種至6孔板，每實(shí)驗(yàn)孔分別加入1 ml細(xì)胞懸液及1 ml 10%細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后，置入37℃的5%CO2培養(yǎng)箱，孵育培養(yǎng)48 h;棄培養(yǎng)液，收集各組細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組分別加入195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液，5 μl Annexin V-FITC 及 80 μl碘化吡啶，輕輕搖晃，室溫避光，孵育 20 min，待上機(jī)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 支鏈siRNA多靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖活性的影響 在24 h，Mixture組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Mixture組與其余各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);在48 h，Mixture組分別與正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與 siRNA-STAT6組、siRNA-STAT5a及 siRNA-STAT5b組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siRNA-STAT3組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在72 h，Mixture組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與其余各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 支鏈siRNA多靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡率的影響 在48 h，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均明顯低于Mixtrue組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明支鏈siRNA多靶點(diǎn)具有明顯誘導(dǎo)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡的作用，見表1。

表1 支鏈RNA多靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖活性及凋亡率的影響()

表1 支鏈RNA多靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖活性及凋亡率的影響()

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與陰性對(duì)照組比較:2)P＜0.01，與Mixture組比較:3)P＜0.05

組別 增殖活性(OD，n=4)24 h 48 h 72 h凋亡率(%，n=3)正常對(duì)照組 0.28±0.01 0.57±0.05 0.71±0.06 5．17±1．223)陰性對(duì)照組 0.26±0.04 0.57±0.03 0.70±0.02 6．70±0．323)siRNA-STAT3 組 0.24±0.06 0.46±0.021) 0.63±0.07 15．80±1．783)siRNA-STAT6 組 0.24±0.04 0.56±0.093) 0.63±0.05 8．59±2．203)siRNA-STAT5a 組 0.27±0.03 0.47±0.093) 0.62±0.09 11．89±1．373)siRNA-STAT5b 組 0.26±0.02 0.49±0.074) 0.64±0.04 11．98±1．933)Mixtrue 組 0.22±0.011)0.37±0.041)2)0.54±0.061)28．86±2．54

3 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)家族在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了及其重要作用。其中STAT3在惡性腫瘤中的研究最為廣泛，并且參與了多種腫瘤的信號(hào)通路和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路如乳腺癌、肺癌及肝癌等。研究顯示，STATS蛋白家族可以被白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子類及某些惡性腫瘤蛋白等多種胞內(nèi)因子受體激活的一組蛋白，共包括7個(gè)家族成員:如 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及STAT6〔4，5〕。其中，STAT1、STAT5 和 STAT6 的異常表達(dá)可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而STAT3作為惡性腫瘤治療的位點(diǎn)，因?yàn)镾TAT3激活后可產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，抑制了STAT3的過(guò)度表達(dá)不僅阻滯惡性腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，同時(shí)還增強(qiáng)體內(nèi)對(duì)腫瘤的免疫能力〔6〕。有研究報(bào)道，STAT5a在信號(hào)通路中的作用及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控研究較為廣泛，STAT5a在乳腺組織正常發(fā)育過(guò)程中具有突出作用〔7，8〕，STAT5a 與 STAT5b 與乳腺癌病理生理學(xué)密切相關(guān)。STAT5a與STAT5b是最常見的轉(zhuǎn)錄因子組合，在調(diào)節(jié)乳腺癌上皮惡性腫瘤方面具有雙重作用〔9〕。STAT5a的激活在調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)與分化方面和乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔10〕。研究表明，STAT6不僅在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生相關(guān)〔11～15〕。

迄今為止，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如放、化療及免疫治療等存在著諸多局限性，RNAi作為新型的基因沉默技術(shù)，具有高特異性抑制靶基因的表達(dá)、療效顯著、副作用輕微等優(yōu)點(diǎn)〔16，17〕，研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常表達(dá)在腫瘤進(jìn)程中起著重要作用〔18〕。惡性細(xì)胞無(wú)限增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要特征，也是腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，也受多種細(xì)胞因子調(diào)控〔19〕。細(xì)胞凋亡與增殖是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要指標(biāo)，這些變化的調(diào)控作為預(yù)兆的信息。因此，細(xì)胞凋亡和分裂指數(shù)關(guān)系到腫瘤患者的生存率〔20〕。本研究證實(shí)支鏈siRNA能夠明顯抑制乳腺癌4T1細(xì)胞增殖及促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。