不同能量密度非剝脫點(diǎn)陣激光早期防治兔耳增生性瘢痕的療效觀察

范婭琦 郭碧蓉 曾維惠 劉亞樂

230061合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 合肥市第一人民醫(yī)院皮膚科（范婭琦、郭碧蓉）；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科（曾維惠、劉亞樂）

增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1］。防治增生性瘢痕的方法主要包括外用硅膠制品、皮損內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素、壓迫療法、激光治療等［2］。目前臨床使用非剝脫點(diǎn)陣激光治療增生性瘢痕技術(shù)已趨于成熟，效果良好且不良反應(yīng)少［3］。2015年，Shim等［1］使用1 550 nm點(diǎn)陣激光治療早期增生性瘢痕時發(fā)現(xiàn)，相同總能量下，高能量低密度的設(shè)定能夠更好地防治增生性瘢痕的發(fā)生，但其機(jī)制尚不明確。基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP?13）可直接或間接參與膠原形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)［4］。本研究通過兔耳瘢痕模型，研究使用不同能量和密度的非剝脫點(diǎn)陣激光，在兔耳增生性瘢痕形成早期進(jìn)行干預(yù)，觀察膠原分布、真皮厚度，觀察MMP?13表達(dá)情況，探討最佳的治療參數(shù)以及可能的機(jī)制。

一、材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動物：健康新西蘭大耳白兔12只，雌雄各半，體重2.5～3.0 kg，月齡3～5個月，單籠飼養(yǎng)，均購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。（合格證號：SCXK陜2014-003）

2.增生性瘢痕模型構(gòu)建：兔耳增生性瘢痕模型的構(gòu)建參考李薈元和蘭海［5］的研究。麻醉兔后，每只兔耳切除5個直徑1 cm區(qū)域兔耳全層皮膚，并刮除軟骨膜，形成5個圓形創(chuàng)面，徹底止血，創(chuàng)面暴露。每個創(chuàng)面間隔1 cm以上。為預(yù)防感染，連續(xù)3 d給予青霉素皮下注射。由2名皮膚科醫(yī)師觀察瘢痕組織愈合情況及瘢痕增生、瘢痕形態(tài)變化。瘢痕造模約2周后，10只大耳白兔成功形成61處增生性瘢痕，瘢痕組織基本上皮化完成，局部皮膚變白，稍突出皮面，觸之質(zhì)硬，痂皮已脫落，可進(jìn)行試驗(yàn)。余2只大耳白兔作為空白對照組，未行瘢痕組織造模，在同一條件下飼養(yǎng)。造模結(jié)束后，將10只大耳白兔隨機(jī)分為2組（1周組和3周組），每組5只。另2只1只隨機(jī)入1周組取材，另1只入3周組取材。

取材時，分別沿兔耳創(chuàng)面邊緣0.5 cm處環(huán)行切開，切取含創(chuàng)面的兔耳組織，每個標(biāo)本沿直徑切開。正常對照組取直徑1.5 cm的圓形皮膚組織。4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作0.4 mm組織切片，切片烤后-20℃保存，另一半放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇及分組：根據(jù)文獻(xiàn)［1，3］，預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)定10、30、50、70 mJ 4個能量階梯，設(shè)定密度不變，測定MMP?13表達(dá)水平。10 mJ與30 mJ組、30 mJ與50 mJ組MMP?13水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而50 mJ與70 mJ組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且部分70 mJ組兔耳激光術(shù)后紅腫明顯。故本研究設(shè)定6組，分別為A組：激光密度100 PPA，能量10 mJ；B組：激光密度100 PPA，能量50 mJ；C組：激光密度169 PPA，能量10 mJ；D組：激光密度169 PPA，能量50 mJ；E組：未行激光處理的瘢痕組織；F組：空白對照組，正常皮膚，未行瘢痕造模處理。各激光組采取相應(yīng)組別參數(shù)激光處理，每次30 s，重復(fù)3次，操作間隔1 min。采用Er?glass 1 550 nm非剝脫點(diǎn)陣激光機(jī)（韓國Sellas公司），激光處理形狀設(shè)定為圓形，直徑1 cm。

4.MMP?13水平測定：1周組30處上皮化組織，按編號隨機(jī)分為5組，即A、B、C、D、E組，每組6處。激光處理后1周，處死1周組所有兔子取材，制作蠟塊切片后行免疫組化法測定MMP?13水平。每個切片隨機(jī)選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0多媒體圖像處理軟件測定MMP?13抗原表達(dá)的平均吸光度。

5.HE、Masson染色：3周組31處上皮化組織，按編號隨機(jī)分為5組，即A、B、C、D組各為6處，E組為7處。激光處理后3周，處死3周組所有兔子取材。制作蠟塊切片后行HE、Masson染色，光鏡下觀察真皮層厚度及膠原增生情況；用微尺測出兔耳瘢痕增生塊厚度（自瘢痕表面至軟骨表面）及兔耳瘢痕鄰近腹側(cè)正常皮膚厚度（自皮膚表面至軟骨表面）。瘢痕增生指數(shù)=（兔耳瘢痕增生塊厚度+兔耳瘢痕鄰近正常皮膚厚度）/兔耳正常皮膚厚度。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，各組數(shù)據(jù)以±s表示。符合正態(tài)分布和方差齊性的采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布但方差不齊的采用Kruskal?Wallis H檢驗(yàn)，采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

二、結(jié)果

1.肉眼觀：10只大耳白兔共成功造模形成61處增生性瘢痕。治療前，各組上皮化組織中央均為肉芽組織，較周圍皮膚局部稍隆起，呈淡紅色或深紅色，觸之質(zhì)硬，稍增厚，表面覆少量痂皮。激光治療后1周時，上皮化組織顏色變淡，厚度降低不明顯。激光治療后3周時，瘢痕組織創(chuàng)面完全上皮化，可見A、B、C、D治療組相較E組（未處理瘢痕組）增生不明顯，增生組織稍軟化。

2.HE染色：F組（正常皮膚組織）表皮組織薄，真皮在各組中最薄，且真皮膠原纖維條帶狀排列，相對較整齊；與F組比較，E組（未處理瘢痕組）真皮層厚度明顯增加，膠原纖維數(shù)量增多，致密粗大，排列呈漩渦狀或結(jié)節(jié)狀；A、B、C、D激光處理各組真皮層厚度增厚，膠原纖維數(shù)量增加，但比E組真皮薄，膠原纖維數(shù)量減少、排列相對有秩。A、B、C、D激光處理組間真皮層厚度未見明顯差異（圖1）。采用Kruskal?Wallis H檢驗(yàn)分析，6組瘢痕增生指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=22.757，P＜ 0.05），兩兩多重比較顯示，B、C、D組顯著低于E組（均P＜0.05）。見表1。

3.Masson染色：F組真皮深層膠原纖維排列規(guī)律且厚度相對較??；E組真皮膠原纖維厚度明顯增厚，排列紊亂，呈結(jié)節(jié)狀或漩渦狀。A、B、C、D激光處理各組真皮層厚度較E組明顯變薄，膠原纖維排列不規(guī)則。而A、B、C、D激光處理各組間真皮層厚度及膠原纖維數(shù)量未見明顯差別（圖2）。

表1 6組大耳白兔經(jīng)不同處理后瘢痕增生指數(shù)和MMP?13平均吸光度（±s）

表1 6組大耳白兔經(jīng)不同處理后瘢痕增生指數(shù)和MMP?13平均吸光度（±s）

注：n=6。MMP?13：基質(zhì)金屬蛋白酶13

圖1 HE染色觀察不同能量密度非剝脫點(diǎn)陣激光處理兔耳增生性瘢痕后的真皮厚度（×100） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

圖2 Masson染色觀察不同能量密度非剝脫點(diǎn)陣激光處理兔耳增生性瘢痕后的膠原纖維情況（×100） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

圖3 不同能量密度非剝脫點(diǎn)陣激光處理兔耳增生性瘢痕后MMP?13蛋白表達(dá)（免疫組化×400） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

4.免疫組化檢測MMP?13的表達(dá)：MMP?13主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞，表皮基底細(xì)胞中也有少量表達(dá)（圖3）。6組MMP?13平均吸光度見表1。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組吸光度符合方差齊性（F=0.678，P=0.643）。單因素方差分析顯示，6組間MMP?13平均吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 462.07，P ＜ 0.01）。LSD?t檢驗(yàn)兩兩多重比較顯示，A、B、C、D組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞MMP?13的表達(dá)水平顯著高于E組和F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。D組MMP?13彌漫表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中。同樣密度不同能量組間比較顯示，D組顯著高于C組（P＜0.01），B組顯著高于A組（P＜0.01）。同樣能量不同密度組間比較顯示，A組顯著高于C組（P＜0.01），B組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。E組顯著高于F組（P＜0.05），B組顯著高于C組（P ＜0.01）。

三、討論

增生性瘢痕的治療方法多種多樣，激光療法中，非剝脫點(diǎn)陣激光較為溫和，不損傷表皮屏障，術(shù)后誤工期短，且并發(fā)癥相對較少。同時衡量效果與風(fēng)險，非剝脫點(diǎn)陣激光往往被認(rèn)為是一種較安全的治療方式。已有醫(yī)師嘗試使用非剝脫點(diǎn)陣激光在手術(shù)后早期對可能產(chǎn)生瘢痕的傷口進(jìn)行治療，無論是溫哥華瘢痕指數(shù)還是雙盲醫(yī)師對治療前后照片評分的結(jié)果，均顯示治療有效［6］。

非剝脫點(diǎn)陣激光治療瘢痕的機(jī)制，可能是通過抑制成纖維細(xì)胞活性從而抑制瘢痕形成。在增生性瘢痕形成的早期，成纖維細(xì)胞增殖增加且凋亡減少，從而導(dǎo)致膠原纖維產(chǎn)生增多，同時瘢痕中的成纖維細(xì)胞MMP表達(dá)減少，而MMP抑制劑表達(dá)增加［7］。MMP作為降解膠原纖維的主要成分，其表達(dá)水平降低，則其降解膠原的作用減弱，從而導(dǎo)致真皮層膠原堆積，最終形成增厚變硬的瘢痕組織。研究顯示［7?8］，MMP表達(dá)增加對增生性瘢痕的形成起重要作用，故而測定MMP蛋白的表達(dá)水平，可初步定性治療的有效性。本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，MMP?13表達(dá)較少，而瘢痕造模后表達(dá)增加，激光處理后MMP?13表達(dá)顯著增加，說明激光治療可以提高M(jìn)MP?13的表達(dá)，促進(jìn)膠原降解。

本研究發(fā)現(xiàn)，各激光處理組3周后的膠原纖維明顯變薄，各激光處理組瘢痕增生指數(shù)均較瘢痕組明顯降低，真皮膠原纖維厚度、膠原纖維排列及瘢痕增生指數(shù)在A、B、C、D組間未見明顯差異，延長觀察時長可能可以觀察到對膠原增生的影響。而且，治療次數(shù)如果增加，對于膠原增生的抑制效果可能也會隨之增加。

點(diǎn)陣激光的特點(diǎn)之一是存在微治療區(qū)，能量和密度是決定治療效果的重要參數(shù)［9］。在治療過程中，微治療區(qū)以外的組織均未受到損傷，組織細(xì)胞可以移行到損傷區(qū)域，并進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)，在此過程中存在膠原重組和血管再生。增加密度，損傷區(qū)域增加，創(chuàng)傷加大，對組織的刺激也較大，面臨損傷過度的風(fēng)險。本研究顯示，在相同密度下，給予較高能量相比于低能量治療，MMP?13水平顯著增加。相同能量下，激光密度的設(shè)定對MMP?13表達(dá)的影響有待進(jìn)一步研究，但激光密度的增加可能會加大組織的損傷，不能起到改善治療的作用，而低密度激光的副作用及疼痛感更小。因此，應(yīng)優(yōu)先選擇低密度激光。能量的大小決定同一波長下治療的深度，能量越大，達(dá)到的深度越深。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用了同一密度下10、30、50、70 mJ不同能量的激光，發(fā)現(xiàn)10 mJ組與30 mJ組及30 mJ組與50 mJ組MMP?13表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為激光能量增高，MMP?13表達(dá)增加，提高激光能量可能促進(jìn)膠原的降解，從而抑制瘢痕形成。而50 mJ組與70 mJ組MMP?13表達(dá)未見明顯差異，說明能量并非越高越好，適當(dāng)提高能量能夠增加療效。因此，高能量低密度的參數(shù)被認(rèn)為是合適的參數(shù)。

本研究顯示，無論采用何種參數(shù)的非剝脫點(diǎn)陣激光進(jìn)行治療，對增生性瘢痕均能起到早期防治作用。同樣能量下，激光密度的變化對MMP?13的表達(dá)影響不大，而同樣密度下，高能量激光比低能量激光更能刺激MMP?13表達(dá)。結(jié)合臨床試驗(yàn)［1］，高能量低密度被認(rèn)為是最佳治療參數(shù)。

本研究中，使用各個能量密度的非剝脫點(diǎn)陣激光均能有效刺激MMP?13表達(dá)增加，且膠原纖維厚度明顯變薄，說明非剝脫點(diǎn)陣激光早期防治增生性瘢痕有效。但由于觀察時長的限制，未能進(jìn)一步觀察治療后數(shù)月的情況。此外，本研究使用兔耳增生性瘢痕組織，其增生期比人瘢痕組織短，激光干預(yù)次數(shù)也較臨床多，存在著術(shù)后紅腫的高風(fēng)險，因此，臨床應(yīng)用中使用高能量激光時需慎重。總之，使用非剝脫點(diǎn)陣激光治療增生性瘢痕的最佳治療時機(jī)及最佳治療次數(shù)仍然要依據(jù)增生性瘢痕的發(fā)生原因以及患者的期待值而定。