固本防哮飲含藥血清對IL-4刺激的人支氣管上皮細胞中IL-27及其信號通路JAK2/STAT1的影響

馬鳳娟，袁雪晶，牛肖飛

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學兒科研究所，江蘇 南京 210029)

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，其發(fā)病率和病死率在全世界范圍內呈上升的趨勢，據全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)預計，2025年全球哮喘患者將增加至4億[1]。目前緩解期的治療主要以吸入性糖皮質激素、長效β2受體激動劑及白三烯受體拮抗劑為主。國外臨床研究表明，長期使用糖皮質激素，與使用安慰劑相比，其遠期療效并不高，且具有一定的副作用[2]。固本防哮飲是江蘇省中醫(yī)院著名兒科專家江育仁教授治療兒童哮喘緩解期的經驗方，由玉屏風散和二陳湯加減化裁而來，具有補肺固表、健脾化痰的功效。臨床研究發(fā)現該方在治療兒童緩解期哮喘方面有顯著效果。本實驗主要通過體外實驗選擇IL-27及其介導的JAK2/STAT1信號通路作為指標來進一步探討固本防哮飲防治哮喘的內在機制。

1 材料與方法

1.1 動物

選取SPF級SD雌性大鼠15只，體質量250 g左右，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCKK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，溫度控制在22～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%，光照12 h,自由飲水、采食。本實驗經南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，倫理號為202005A041。將大鼠隨機分為空白組、孟魯司特組和固本防哮飲組，每組各5只。

1.2 細胞

人支氣管上皮細胞(16HBE)由南京中醫(yī)藥大學兒科研究所饋贈，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3 藥物

固本防哮飲組方：炙黃芪15 g，黨參10 g，白術10 g，茯苓10 g，煅牡蠣15 g，蟬蛻10 g，陳皮6 g，防風6 g，辛夷6 g，五味子6 g和生甘草3 g。飲片均購于江蘇省中醫(yī)院，經江蘇省中醫(yī)院張芹副主任中藥師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。取8倍量冷水浸藥30 min，煎煮30 min(沸后)，濾過；再加6倍量水煎煮30 min，將2次煎液過濾，中藥旋蒸儀上旋蒸濃縮成含生藥量2 g/mL的溶液，密封于無菌量瓶，4 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｃ萧斔固剽c片(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.4 試劑

重組IL-4細胞因子(Proteintech公司，批號：200-04-20)；胎牛血清(上海源培生物科技股份有限公司，批號：04-001-1ACS)、RPMI 1640(上海源培生物科技股份有限公司，批號：L210KJ)；0.25%胰酶(批號：S310JV)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thero pierce，批號：23227)；RIPA裂解液、PMSF(上海碧云天生物技術公司，批號：BL504A、BL507A)；ECL發(fā)光液(上海翊圣生物科技公司，批號：36208E60)；兔抗STAT1、JAK2多克隆抗體(美國Immunoway公司，批號：YT6124、YT2426)；總RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,批號：RC101-01)；IL-27 RNA引物、STAT1、JAK2 RNA引物、GAPDH引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；人IL-27 ELISA試劑盒(上海西塘生物科技公司)。

1.5 儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；Chemi-Doc化學發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；Western Blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)；蛋白核酸分析儀、PCR逆轉錄儀(德國 Eppendorf公司)；熒光定量PCR 儀(型號:Quantstudio 7Flex，美國Life technologies)；多功能酶標儀(Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，參照實驗動物和人體臨床用藥劑量換算公式(公式1)進行計算[3]。然后按照20 g/(kg·d)的固本防哮飲生藥量及孟魯司特1 mg/(kg·d)灌胃，空白組給予等量的生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)給藥3 d，末次給藥1 h后，局部麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置1 h后無菌離心取血清，56 ℃水浴鍋滅活30 min后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)

2.2 CCK8法測定含藥血清的最大無毒濃度

細胞計數后按每孔8 000個細胞接種于兩塊96孔板中，除去四周加PBS孔，每塊從左到右依次加入100 μL濃度為5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%的含藥血清，另設一組空白組和一組單培組，每組設3個復孔，培養(yǎng)12、24 h后分別取出一塊96孔板，加入CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀測定波長在450 nm處的OD值。本實驗選取細胞加入含藥血清培養(yǎng)24 h后加入CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h后的OD值，以細胞存活率90%以上計算最大無毒濃度(公式2)。

細胞活力(%)=(A實驗-A空白)/(A正常-A空白)×100%

(2)

2.3 細胞模型的建立、實驗分組及給藥

選取人支氣管上皮細胞(16HBE)，培養(yǎng)于T25瓶，至于環(huán)境條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞鋪滿單層后予以胰酶消化后傳代，并以5×105/mL的濃度接種于6孔板中，貼壁生長約70%～80%，模型組及給藥組予以IL-4細胞因子以100 ng/mL濃度干預24 h造模[4]。

實驗分組：正常組、模型組、孟魯司特組和固本防哮飲低劑量組、中劑量組、高劑量組(藥物干預均在模型基礎上干預)。

藥物干預劑量：正常組(10%空白含藥血清),模型組(10%空白含藥血清),孟魯司特組(10%孟魯司特含藥血清),固本防哮飲低劑量組(5%固本防哮飲含藥血清)，中劑量組(10%固本防哮飲含藥血清)、高劑量組(15%固本防哮飲含藥血清)，干預時間均為24 h。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 ELISA法檢測細胞上清液中IL-27的表達水平

本實驗采用上海西塘生物科技公司的人IL-27 ELISA檢測試劑盒，具體操作步驟詳見說明書。

2.4.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中JAK2、STAT1蛋白的表達水平

收集細胞，濃度為2×106～5×106/mL,加入RIPA裂解液50 μL,離心后取上清，采用BCA法測定蛋白濃度(按Thermo試劑盒說明書操作)，將蛋白濃度設定為2 μg/μL，按照原液體積+水的體積：5×上樣緩沖液=4∶1的比例進行稀釋后煮沸變性。配8%的分離膠，5%的積層膠，取蛋白上樣量為30 μg,設定S1(積層膠)電壓為80 V，30 min；S2(分離膠)電壓110 V，進行恒壓垂直電泳1 h。電泳結束后采用濕轉法進行轉膜，恒流300 mA，100 min。轉膜結束后予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后予以5%的BSA封閉1 h，封閉結束后繼續(xù)予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜結束后分別加入1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000稀釋度的兔抗鼠JAK2、STAT1、TUBLIN一抗孵育，4 ℃過夜。一抗孵育結束后予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后在室溫下孵育稀釋度為1∶5 000的二抗1 h，孵育完畢后再次予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后予以均勻添加ECL發(fā)光液，上機曝光。使用Image J 軟件量化條帶的灰度值，把目的條帶的灰度值與內參的灰度值的比值作為目的基因蛋白的相對表達量。

2.4.3 實時定量PCR(Real-time RT-qPCR)檢測細胞中IL-27、JAK2、STAT1的mRNA表達水平

按照諾唯贊總RNA試劑盒步驟提取RNA，紫外分光光度計測其濃度。按照諾唯贊逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA。設計上述指標的引物，以GAPDH為內參對照(引物序列詳見表1)。按照20 μL體系(SYBR 10 μL、前引、后引各0.4 μL、DEPC水7.2 μL、cDNA 2 μL)加入96孔板內。三步法進行Real-time RT-qPCR檢測，第一步95 ℃ 30 s；第二步95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s；第三步 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)。結果以內參GAPDH進行校準，以2-△△CT公式計算。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad prism 8.0數據分析軟件進行數據分析，采用單因素方差分析(one-way ANVOA)比較各組間差異的顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同稀釋度的固本防哮飲含藥血清對16HBE細胞存活率的影響

在16HBE細胞中，不同稀釋度固本防哮飲含藥血清對細胞存活率的影響見表2。本實驗采取細胞存活率>90%的濃度為最大無毒濃度，故選用15%的固本防哮飲含藥血清濃度度為最大無毒濃度，以5%為固本防哮飲低劑量組、10%為固本防哮飲中劑量組、15%為固本防哮飲高劑量組。

表2 固本防哮飲含藥血清對16HBE細胞的影響

3.2 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞中IL-27蛋白的表達水平

與空白組相比，模型組細胞中IL-27表達水平顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；4個治療組與模型組相比，細胞中IL-27表達水平均有明顯降低，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；但固本防哮飲各劑量組與孟魯司特組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；固本防哮飲各劑量組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 ELISA法檢測各組細胞中IL-27蛋白表達水平

3.3 Western blot法測定細胞中JAK2、STAT1蛋白的表達水平

與空白組相比，模型組中JAK2、STAT1均顯著升高；與模型組相比，4個治療組中JAK2、STAT1蛋白表達水平均降低，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；孟魯司特組與固本防哮飲各劑量組相比，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；固本防哮飲各劑量組之間相比,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表4和圖1。

表4 Western Blot法檢測各組細胞中JAK2、STAT1蛋白表達水平

3.4 Real-time RT-qPCR法檢測細胞中IL-27、JAK2、STAT1 mRNA的表達

與空白組對比，模型組中IL-27、JAK2、STAT1 mRNA均升高；與模型組相比，固本防哮飲各劑量組及孟魯司特組均下調，其差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；孟魯司特組與固本防哮飲各劑量組相比，無統(tǒng)計學意義，且固本防哮飲各劑量組之間比較，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表5。

4 討論

支氣管哮喘是由多種細胞(如氣道上皮細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等)和細胞因子參與的以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病。哮喘發(fā)病機制有多種假說，其中最經典的是Th1/Th2失衡學說。固有的Th2細胞穩(wěn)定性是治療過敏性疾病的重要障礙，因此免疫治療方面的研究都是旨在抑制Th2反應，誘導Th1反應，從而調節(jié)Th1/Th2平衡。

注：A.空白組；B.模型組；C.孟魯司特鈉組；D.固本防哮飲低劑量組；E.固本防哮飲中劑量組；F.固本防哮飲高劑量組。圖1 各組細胞中JAK2、STAT1蛋白免疫印跡圖

表5 各組細胞中IL-27、JAK2、STAT1基因表達水平

IL-4主要由Th2細胞分泌，并通過釋放IgE和促炎因子在哮喘的氣道炎癥和氣道高反應性中發(fā)揮重要作用[4]。人支氣管上皮細胞是炎癥反應的主要靶細胞，在哮喘炎癥修復過程中起關鍵作用[5]。IL-27是IL-12家族的新成員, 它是由兩個亞基P28和EBI3組成的異二聚體分子,主要由活化的抗原呈遞細胞(尤其是樹突狀細胞和肺巨噬細胞)產生[6]。IL-27可以協同促進初始CD4+T細胞產生IFN-γ，并促進Th0細胞分化為Th1細胞，并具有抑制Th2細胞功能的作用[7]。研究發(fā)現[8],與野生型小鼠相比，EBI3缺陷的小鼠表現為更嚴重的氣道高反應性。在健康的人類外周血中，IL-27 可以讓CD4+T細胞增殖，并加速向Th1細胞分化，從而起到防范哮喘的作用；但對于哮喘患者這種反應卻不明顯，這可能與IL-27能抑制初始的CD4+T細胞的Th2分化，但無法抑制已分化的Th2細胞的再分化有關[9]。Chen等[10]研究發(fā)現血清IL-4水平高的哮喘患者，Th2細胞分化受IL-27抑制并不明顯，重復或高劑量IL-4刺激可誘導Th2細胞抵抗IL-27介導的抑制。蘇孝瓊等[11]為了探究IL-27處理后小鼠T淋巴細胞的信號傳遞，采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除小鼠，發(fā)現僅STAT1敲除可抵消IL-27的效應，證實IL-27是借助STAT1信號通路活化而傳遞信號的。JAK/STAT信號傳導通路通過激活STAT1參與IL-4等細胞因子的信號傳導過程，從而誘導下游靶基因的表達，進而引起哮喘患者氣道高反應和慢性氣道炎癥反應[12]。

固本防哮飲是江蘇省中醫(yī)院江育仁教授基于“扶正固本”的指導思想下形成的治療哮喘的經驗方，“預防”為治療的著重點，由炙黃芪、黨參、白術、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風、辛夷、五味子和生甘草組成，具有補肺固表、健脾化痰的功效，療效確切，臨床可增強患兒體質，減少哮喘發(fā)作次數，提高患兒的生存質量。課題組前期通過臨床隨機對照試驗觀察發(fā)現,哮喘緩解期治療組使用固本防哮飲聯合定喘敷貼膏有效率高于布地奈德對照組[13]，且通過動物實驗研究發(fā)現其可通過上調TLR4、TLR7達到防治哮喘的目的[14]。

本實驗在體外通過IL-4細胞因子刺激支氣管上皮細胞構建哮喘慢性氣道炎癥模型，而孟魯司特鈉為兒童哮喘緩解期常用的口服控制性藥物，因此選為對照藥物。與空白組相比，模型組中IL-27、JAK2、STAT1蛋白和mRNA表達均上調，可見IL-27在本實驗中起促炎性因子的作用；且通過誘導JAK2/STAT1信號通路的激活引起氣道慢性炎癥；固本防哮飲含藥血清干預后，與模型組相比，IL-27、JAK2、STAT1蛋白和mRNA表達均下調，表明固本防哮飲可能通過下調IL-27及其JAK2/STAT1信號通路的相關因子起調控作用。