AQP2、γ-ENaC、NHE3在陰虛水腫證大鼠腎臟的表達改變及意義※

徐文峰何澤云唐 群彭亞平彭亞軍李旭華陳 濤

（1 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，湖南 長沙 410000；2 湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410000；3 湖南中醫(yī)藥大學研究生院，湖南 長沙 410000）

水腫是腎科常見癥狀，研究表明水通道蛋白2（AQP2）、γ型上皮鈉通道 （γ-ENaC）、Na+/H+交換體3（NHE3）表達異常在水腫發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本課題組結(jié)合前期工作以阿霉素腎病大鼠為基礎，結(jié)合連續(xù)優(yōu)甲樂灌胃制備陰虛水腫證模型，觀察上述水鈉因子表達改變，為后續(xù)闡明中醫(yī)藥干預陰虛水腫證提供實驗動物模型及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 動物 50只雄性SPF級146～182 g Wistar大鼠由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供 [SYSK（湘） 2013-0005]，飼養(yǎng)于動物中心實驗室，每籠5只，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，隔日更換墊料。

1.2 藥物 注射用鹽酸多柔比星（阿霉素，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，10 mg/支），1支溶解于注射用水5 mL中，每毫升藥液含2 mg阿霉素。左旋甲狀腺素鈉片（優(yōu)甲樂，德國默克公司，50 μg/片），5片研碎溶解于注射用水5 mL，每毫升藥液含50 μg優(yōu)甲樂。

1.3 動物分組及干預方法 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，體質(zhì)量約200 g后棄去尿蛋白陽性大鼠（尿蛋白試紙檢測），隨機分為空白組（20只，不做處理）、對照組（5只，尾靜脈注射生理鹽水）、阿霉素組（25只，尾靜脈注射阿霉素），2周后24 h尿蛋白定量≥100 mg提示阿霉素腎病模型復制成功，棄去對照組、造模失敗及死亡大鼠（共8只），重新分為空白組（20只，不做處理）、陰虛水腫組（阿霉素模型基礎上連續(xù)灌服優(yōu)甲樂懸液，22只），分別于灌胃2周、4周、6周、8周將部分大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，稱重后麻醉，腹主動脈取血，剪皮并留取腎臟。

1.4 阿霉素腎病模型制備 75%酒精反復擦拭尾靜脈，以6 mg/kg劑量一次性尾靜脈注射阿霉素，注射2周后收集24 h尿液，24 h尿蛋白定量≥100 mg提示模型復制成功。

1.5 連續(xù)優(yōu)甲樂懸液灌服 左旋甲狀腺素鈉片（50 μg/片）5片研碎溶解于注射用水5 mL，每毫升藥液含50 μg優(yōu)甲樂。大鼠稱重后以50 μg/100 g劑量連續(xù)灌服左甲狀腺素鈉。

1.6 指標檢測及方法

1.6.1 大鼠一般情況 觀察大鼠精神狀態(tài)、活動度、肛溫、體重、尿量、糞便性狀、皮膚含水量、背毛色澤等。

1.6.2 生化指標 采用RT-1904C半自動生化儀檢測24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、腎功能等，Elisa試劑盒檢測大鼠TT3、TT4、TSH。

1.6.3 腎臟病理檢查 所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片（厚為3～5 μm），免疫組織化學法觀察AQP2、γ-ENaC、NHE3表達，Motic BA410T顯微鏡拍照。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以 （±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，滿足正態(tài)性、方差齊性多組比較采用LSD法，不滿足正態(tài)性、方差齊性多組比較采用Tamhane’s T2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 阿霉素注射3 d后大鼠逐漸出現(xiàn)團縮，活動減少，便溏，飲食飲水減少，爛尾，背毛雜亂，脫毛，2周后大鼠陰囊水腫明顯，空白組未出現(xiàn)上述情況，第4周陰虛水腫組大鼠皮膚含水量高于空白組（P＜0.05），提示水腫形成，連續(xù)優(yōu)甲樂灌胃2周后陰虛水腫組大鼠活動頻繁，躁動不安，易激惹，飲水量多，鼠籠墊料潮濕，排泄物增多，脫毛，四肢及陰囊水腫明顯，肛溫高于空白組（P＜0.05），符合“陰虛”表現(xiàn)，灌胃2、4周陰虛水腫組大鼠TT3高于空白組（P＜0.05），灌胃2、4、6、8周陰虛水腫組大鼠TT4高于空白組（P＜0.05），提示陰虛模型復制成功，見表1。

表1 大鼠水腫、陰虛指標比較 （±s）

表1 大鼠水腫、陰虛指標比較 （±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05

優(yōu)甲樂灌胃2周肛溫（℃）空白組 66.60±1.14 36.60±0.35 1.13±0.42陰虛水腫組 70.25±1.26★ 37.36±0.30★ 1.97±0.27★組別 尾靜脈注射第4周皮膚含水量（%）優(yōu)甲樂灌胃4周TT3（nmol/L） TT4（nmol/L） TSH（μIU/mL）38.06±10.56 0.71±0.18 151.04±37.98★ 0.79±0.20

第8周陰虛水腫組大鼠體重、24 h尿量、血清白蛋白低于空白組，尿蛋白定量、血肌酐高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。8周內(nèi)陰虛水腫組大鼠死亡4只。

表2 實驗8周后大鼠部分指標比較 （±s）

表2 實驗8周后大鼠部分指標比較 （±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05

尿蛋白定量(mg/24 h)空白組 579.80±17.05 36.80±12.79 15.86±2.89陰虛水腫組 233.25±29.74★ 17.50±5.45★ 387.73±68.46★組別 體重(g)血肌酐(μmol/L)38.80±3.96 26.80±9.65 19.50±3.70★ 56.75±10.81★24 h尿量(mL)血清白蛋白(g/L)

2.2 各組大鼠腎臟AQP2、γ-ENaC、NHE3免疫組化分析 見圖1、表2～5。

圖1 灌胃8周免疫組化×400倍

表3 大鼠腎臟AQP2蛋白表達量比較 （±s）

表3 大鼠腎臟AQP2蛋白表達量比較 （±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05

組別 灌胃2周 4周 6周空白組 8712.44±1347.83 11574.33±2107.33 10754.27±2147.07陰虛水腫組 29475.37±2345.62★ 25651.61±3642.91★ 23692.53±3854.55★8周11047.39±1975.46 20547.22±2967.49★

表4 大鼠腎臟γ-ENaC蛋白表達量比較 （±s）

表4 大鼠腎臟γ-ENaC蛋白表達量比較 （±s）

注：與空白組相比，★P＜0.05；與灌胃2周相比，②P＜0.05

組別 灌胃2周 4周 6周空白組 9325.21±1452.83 10973.33±2131.33 9685.27±1915.41陰虛水腫組 15462.53±2678.62★ 18950.16±3326.19★② 17972.35±3125.13★8周10317.39±2716.98 16421.22±3367.49★

表5 大鼠腎臟NHE3蛋白表達量比較 （±s）

表5 大鼠腎臟NHE3蛋白表達量比較 （±s）

注：與空白組相比，★P＜0.05；與灌胃2周相比，②P＜0.05

組別 灌胃2周 4周 6周空白組 8325.21±1522.83 10983.33±2011.33 9865.27±2315.41陰虛水腫組 15338.53±2678.62★ 28350.16±4326.19★② 26982.35±4538.23★8周10012.39±2516.98 24523.22±3652.49★

3 討論

腎病綜合征（NS）是腎科常見疾病，水腫是其特征性表現(xiàn)，部分NS水腫患者治療非常棘手，水腫遷延日久。隨著利尿劑、糖皮質(zhì)激素的使用，臨床常有水腫與傷陰并見之象，此陰虛水腫以發(fā)汗、利尿、健脾、溫腎等法難以奏效，水腫遷延難愈，中醫(yī)學治療水腫療效確切，但目前有關陰虛水腫的理論探討、機理研究相對較少，本研究參照課題組前期工作，結(jié)合優(yōu)甲樂灌胃制備病證結(jié)合的陰虛水腫動物模型，觀察腎臟水鈉因子（AQP2、γ-ENaC、NHE3） 的表達改變。

水通道蛋白 (AQP)是多種組織細胞膜上的特異性通道，調(diào)節(jié)水跨膜轉(zhuǎn)運，Wang Y等[1]觀察腎活檢確診的54例原發(fā)性NS患者，水腫組患者腎組織AQP2陽性面積明顯高于無水腫組，尿AQP2亦顯著高于無水腫組，提示AQP2參與NS患者水腫的發(fā)生發(fā)展。太史春等[2]以大鼠腹腔注射卡那霉素制作“腎氣虛”模型，2周后發(fā)現(xiàn)模型大鼠尿量增加，考慮與AQP2mRNA表達減少進一步導致AQP2生產(chǎn)減少，腎臟集合管重吸收水分減少而產(chǎn)生多尿有關。吳慶昕[3]以大鼠定量化打擊法制備血瘀證模型，1周后模型組腎組織AQP2表達、Western blot表達顯著升高，體現(xiàn)了中醫(yī)學“血不利則為水”，同期予丹參干預可使模型大鼠尿量增加，提示丹參活血利尿功效可能與其降低腎小管AQP2水平有關。

上皮鈉離子通道蛋白（epithelial sodium channel，ENaC）屬于ENaC/Deg超基因家族，主要調(diào)控跨上皮細胞的鈉離子轉(zhuǎn)運。腎病綜合征患者水鈉潴留與γ-ENaC異?；罨芮邢嚓P，尿絲氨酸蛋白酶的分泌有關 (纖溶酶等)可激活γ-ENaC。Bohnert B N等[4]研究發(fā)現(xiàn)抑肽酶對上皮鈉通道沒有直接的抑制作用，但能阻止蛋白水解通道活化。此外，糖皮質(zhì)激素可激發(fā)腎臟集合管Na+的重吸收，增加ENaC活性，導致水鈉潴留[5]。李洪巖等[6]以肌注甘油制備急性腎功能衰竭（ARF）模型，發(fā)現(xiàn)ARF大鼠尿量先升后降，可能是ARF發(fā)生早期以腎小管損傷為主，重吸收障礙因而尿量增加，同時發(fā)現(xiàn)γ-ENaC表達增高，與相對正常腎單位代償性功能增加，增加鈉重吸收有關。

Na+/H+交換體（NHE）是存在于所有真核細胞中的一種跨膜糖蛋白，對細胞內(nèi)外離子的跨膜轉(zhuǎn)運、細胞體積、胞內(nèi)滲透壓的控制、腎臟水鈉重吸收和酸堿平衡起重要的調(diào)控作用。NHE3是調(diào)節(jié)腎臟水鈉重吸收和酸堿平衡的主要亞型。Eschmann V B等[7]發(fā)現(xiàn)PAN腎病大鼠，激活狀態(tài)的NHE3表達增多，重吸收Na+增多，參與水鈉潴留的形成。李洪巖等[8]發(fā)現(xiàn)腎臟局部多巴胺主要通過調(diào)控NHE3、ENaC發(fā)揮利鈉利水作用。張文欣等[9]觀察100例重癥監(jiān)護室急性腎損傷（AKI）患者，AKI組尿NHE3水平顯著升高，升高時間較血清肌酐（Scr）提前24 h，尿NHE3與Scr呈正相關 （r=0.457，P＜0.05）。

本研究以一次性尾靜脈注射阿霉素[10]聯(lián)合連續(xù)優(yōu)甲樂灌胃制備“陰虛水腫”證大鼠模型，尾靜脈注射阿霉素2周后大鼠陰囊水腫明顯，第4周皮膚含水量高于空白組（P＜0.05），提示水腫形成，連續(xù)優(yōu)甲樂灌胃2周后模型組大鼠活動頻繁，躁動不安，易激惹，肛溫、TT3、TT4高于空白組（P＜0.05），符合“陰虛”表現(xiàn)。AQP2蛋白表達量第2周最高 （P＜0.05），γ-ENaC、NHE3蛋白量第4周最高 （P＜0.05），提示AQP2、γ-ENaC、NHE3參與“陰虛水腫”證大鼠水腫的發(fā)生發(fā)展，為進一步闡釋中醫(yī)學治療“陰虛水腫”提供動物模型及實驗數(shù)據(jù)參考。