燒傷膏細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究

曹霞飛 何華紅 吳 婷 李志芳

1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511405；2.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510160

濕潤(rùn)燒傷膏是一種用于各種燒、燙、灼傷的局部給藥制劑，起到清熱解毒、止痛、生機(jī)的作用，其組分中含有黃連、黃柏、黃芩等多種中藥成分[1-3]?！吨袊?guó)藥典》明確規(guī)定，用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無(wú)菌檢查法規(guī)定[4-6]，且應(yīng)嚴(yán)格控制其中的內(nèi)毒素含量。目前《中國(guó)藥典》尚未收載該品種的內(nèi)毒素檢查法。本文對(duì)該供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行探討，建立可行性方法，為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

MS-1型自動(dòng)漩渦震蕩器（德國(guó)IKA）；TW12型六孔水浴箱（日本Julabo）；LK164-03型內(nèi)毒素定量?jī)x（美國(guó)Lab Kinetice Ltd.）；XS204型分析天平（美國(guó) Mettler Toledo.）。

1.2 試劑

濕潤(rùn)燒傷膏：批號(hào)20140704，汕頭美寶制藥有限公司。鱟試劑（TAL）：批號(hào)1309222，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)13030612，福州新北生化工業(yè)有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)150601-201377，規(guī)格70EU/mL；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1303290，規(guī)格50mL/支。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)[6-7]

按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核。取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。按細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的使用說(shuō)明書，用移液管加入1mL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)。置自動(dòng)漩渦混合器上混合30min，即為70EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后再稀釋制成 0.5、0.25、0.125和 0.06EU/mL 四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。具體的稀釋過(guò)程如下：取0.4mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液加上3.6mL BET水即為1∶10稀釋液，得到7EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL的1∶10稀釋液，加上6mL BET水即為1∶70稀釋液，得到1EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取4mL的1∶70稀釋液，加上4mL BET水即為1：140稀釋液，得到0.5EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5mL的1∶140稀釋液，加上5mL BET水即為1：280稀釋液，得到0.25EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6mL的1∶280稀釋液，加上6mL BET水即為1∶560稀釋液，得到0.125EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2mL的1∶560稀釋液，加上2mL BET水即為1∶1120稀釋液，得到0.06EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

取靈敏度標(biāo)示值λ=0.25EU/mL的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)，加入0.1mL BET水復(fù)溶，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。將已充分溶解的待復(fù)鱟試劑18支放在試管架上，其中16管分別加入0.5、0.25、0.125EU/mL和0.06EU/mL四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，2支加入BET水作為陰性對(duì)照。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和BET水的加樣量均為0.1mL/支。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫（60±2）min。見(jiàn)表1。

3批鱟試劑復(fù)核結(jié)果λc均在0.5λ-2λ范圍，均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。

2.2 內(nèi)毒素限值（L）確定

中國(guó)藥典2015版四部通則的細(xì)菌素檢查法關(guān)于內(nèi)毒素限值的確定：濕潤(rùn)燒傷膏臨床使用為外用。涂于燒、燙、灼傷等創(chuàng)面（厚度薄于1mm），每4～ 6h更換新藥。燒傷膏的密度[8]ρ≈1.0g/mL，按人體表面為1.6m2，假設(shè)極端情況患者全身涂滿厚度為1mm的濕潤(rùn)燒傷膏，計(jì)算得到體積：

為了保證濕潤(rùn)燒傷膏用藥安全，根據(jù)藥典中注射劑K=5EU/mL，濕潤(rùn)燒傷膏的K值參考最嚴(yán)格的注射劑限制，即取濕潤(rùn)燒傷膏K=5EU/mL。則：

按1g濕潤(rùn)燒傷膏與2mL正己烷的比例溶解，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（與正己烷按1∶1比例）充分振蕩混勻，萃取水相，故其水相的細(xì)菌內(nèi)毒素限值相當(dāng)于：

2.3 燒傷膏萃取液中細(xì)菌內(nèi)毒素回收率試驗(yàn)[9-11]

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1mL，制成70EU/mL的溶液，密封后，置自動(dòng)漩渦混合器上振蕩30min后取下，用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成 10EU/mL、1.0EU/mL、0.1EU/mL 3 個(gè)濃度的稀釋液，每一濃度做3支平行管。同時(shí)用BET水與鱟試劑反應(yīng)作為陰性對(duì)照。

2.3.2 供試品溶液的制備 取濕潤(rùn)燒傷膏2.25g，加入4.5mL正己烷，放入自動(dòng)漩渦混合器上振蕩（頻率2000r/min，時(shí)間2min），再加入4.5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水繼續(xù)萃取。靜止使之分層后，取萃取液到另一支試管中備用，即樣品空白溶液C0。

將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶（規(guī)格：70EU/mL），加入內(nèi)毒素檢查用水，分別稀釋制成45EU/mL、9EU/mL的待接種液。取一定量的燒傷膏，經(jīng)正己烷萃取后，按一定比例分別加入接種液，以上每一步驟均需混勻，再以2000r/min，繼續(xù)萃取2min，制得終溶度為1.0、0.5、0.3EU/mL供試品溶液，靜止使之分層后，取萃取液標(biāo)記為 C1.0、C0.5、C0.3。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗(yàn)證 根據(jù)《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)顯色法的規(guī)定，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間＞3600S，且大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度反應(yīng)時(shí)間（749.67S），變異系數(shù)（CV）≤10%。將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：LgTg=2.7676-0.1064LgC。相關(guān)系數(shù)R=-0.9997，∣R∣＞ 0.980，見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線成立，試驗(yàn)有效。

表2 動(dòng)態(tài)顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.4 不同接種濃度供試品的回收率比較 為證明樣品中所含內(nèi)毒素能否完全被萃取至待檢測(cè)水溶液中，接種一定量的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品[12]，使外加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的終濃度為1.0、0.5及0.3EU/mL，通過(guò)動(dòng)態(tài)顯色法，分別對(duì)其進(jìn)行回收率試驗(yàn)驗(yàn)證，看其回收率是否在50%～200%范圍內(nèi)。分別向上述各管中加入動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑0.1mL，每個(gè)濃度設(shè)2孔，另取2孔加入0.1mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。振蕩混勻后放入動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀，于(37±1)℃，波長(zhǎng)405nm處測(cè)定各濃度的反應(yīng)時(shí)間，并自動(dòng)計(jì)算出供試品的內(nèi)毒素含量及回收率。見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)定結(jié)果（n=2）

按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量ct和cs，該試驗(yàn)條件下的回收率（R）計(jì)算見(jiàn)式：

樣 品 C1.0的 回 收 率=（2.6311-0.0020）/1.0=262.91%；樣品C0.5的回收率=（0.0142-0.0020）/0.5=2.44%；樣品C0.3的回收率=（0.1590-0.0020）/0.3=52.3%；樣品C0.3的回收率細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率為52.3%，在50%～200%之間。

2.4 水相萃取液凝膠法干擾試驗(yàn)

2.4.1 有效稀釋倍數(shù) 濕潤(rùn)燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：是指在試驗(yàn)中濕潤(rùn)燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。MVD=cL/λ（L為供試品的內(nèi)毒素限值；c為濕潤(rùn)燒傷膏萃取液濃度，當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，則c等于1.0ml/mL；λ為在鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。）試驗(yàn)用鱟試劑靈敏度λ在0.25～0.03EU/mL。則萃取液對(duì)應(yīng)的有效稀倍數(shù)計(jì)算見(jiàn)式：

MVD0.25=0.375/0.25=1.5倍；MVD0.125=0.375/0.125=3倍；MVD0.06=0.375/0.06=6倍；MVD0.03=0.375/0.03=12倍。

2.4.2 干擾預(yù)試驗(yàn) 將濕潤(rùn)燒傷膏萃取液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋1.5、3、6、12倍，將此系列濃度的溶液記為NPC。

同時(shí)在上述溶液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的試驗(yàn)液中均含有2λ（即0.5EU/mL）濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別將NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管。并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。見(jiàn)表4。

表4 水相萃取溶液的干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由以上水相萃取溶液的干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可以初步了解：湛江安度斯生物有限公司對(duì)水相萃取液的細(xì)菌內(nèi)毒素的試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)干擾；福州新北生化工業(yè)有限公司對(duì)水相萃取液的細(xì)菌內(nèi)毒素的試驗(yàn)結(jié)果在進(jìn)行6倍及以下稀釋濃度無(wú)干擾。

2.4.3 水相萃取溶液的凝膠法正式干擾試驗(yàn) 為了最終確定濕潤(rùn)燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液是否存在干擾因素的影響，再進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。用靈敏度為0.25EU/mL，兩個(gè)不同廠家的鱟試劑按中國(guó)藥典2015年版四部通則的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，取萃取液（6倍稀釋），用BET水和供試品稀釋液將對(duì)應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2λ，λ，1/2λ和1/4λ濃度的PPC系列和供試品稀釋液NPC系列，每一稀釋濃度平行4管，同時(shí)用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對(duì)照管，按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和 Et），Es=lg－ 1（Xs/4），Et=lg－1(Xt/4)，見(jiàn)表 5。

其中系列溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）計(jì)算見(jiàn)式：

式中Xs和Xt分別為系列溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），故：

正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明：Es1 和Es2均在0.5λ ～ 2λ（包 括 0.5λ 和 2λ） 及 Et1在 0.5 Es1：2 Es1（包 括 0.5 Es1和 2 Es1）和 Et2在 0.5 Es2～2 Es2（包括0.5 Es2和2 Es2）范圍之內(nèi)，確認(rèn)水相萃取溶液（6倍稀釋）無(wú)干擾影響。

3 討論

濕潤(rùn)燒傷膏為脂溶性藥物[4]，由于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)一般都是在水溶液中進(jìn)行[13]，而濕潤(rùn)燒傷膏不溶于水，因此不能直接進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行過(guò)前期研究證明，正己烷是油脂類合適的溶劑[14]。利用細(xì)菌內(nèi)毒素可溶于水的特性，對(duì)濕潤(rùn)燒傷膏，先用正己烷溶解后，再與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分振蕩混勻，取水相萃取液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。對(duì)此方法我們重點(diǎn)考察了兩方面：首先，考察樣品處理過(guò)程中內(nèi)毒素的回收率，否則對(duì)水相溶液進(jìn)行內(nèi)毒素檢查不能準(zhǔn)確反映樣品中的內(nèi)毒素含量。且考慮不同濃度的內(nèi)毒素在油相和水相溶液中的分配比例可能不同，其回收率存在差異，因此采用濁度法對(duì)外接種內(nèi)毒素多種濃度進(jìn)行回收率試驗(yàn)比較。本研究在國(guó)外實(shí)驗(yàn)室研究[15]的基礎(chǔ)上確證了燒傷膏水相萃取液稀釋6倍及以下濃度無(wú)干擾；外加接種0.3EU/mL內(nèi)毒素回收率為52.3%，符合中國(guó)藥典動(dòng)態(tài)濁度法回收率50%～200%范圍內(nèi)。另兩個(gè)接種濃度（1.0及0.5EU/mL內(nèi)毒素）的回收率分別為262.89%及2.4%，結(jié)果不太理想，原因需做進(jìn)一步探究。其次，盡管脂溶性藥物中的藥物和輔料均難溶于水，但萃取后的水相溶液可能含有藥物和輔料，應(yīng)驗(yàn)證萃取后水相溶液對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有無(wú)干擾作用，這便是我們進(jìn)行干擾試驗(yàn)的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了6倍稀釋濃度的水相萃取液對(duì)兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑均無(wú)干擾作用，Es/Et均在0.5～2.0范圍之內(nèi)。

綜上所述，濕潤(rùn)燒傷膏可以使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢測(cè)，本研究推薦使用動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑對(duì)供試品的6倍稀釋液作內(nèi)毒素檢測(cè)，供試品對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾。為下一步制定燒傷膏的細(xì)菌內(nèi)素檢查方法提供了有力證據(jù)。