高表達(dá)p27基因?qū)ψ訉m頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響研究

王曉慧 阮 杰 羅蘇亞

子宮頸癌為臨床上發(fā)病率較高的一種腫瘤疾病[1]，研究顯示[2]，多種腫瘤疾病患者均伴有程度不一的p27表達(dá)水平下降現(xiàn)象，例如子宮頸癌、甲狀腺癌等，且患者腫瘤惡性程度和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率通常有較大關(guān)聯(lián)。為探討p27基因表達(dá)對(duì)子宮頸癌的影響，本研究中以構(gòu)建p27高表達(dá)HeLa細(xì)胞株的方式進(jìn)行研究，詳細(xì)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)前做好各項(xiàng)材料準(zhǔn)備，包括真核表達(dá)載體pcDNA（購(gòu)自Novagen公司）、工具酶（購(gòu)自Fermentas公司）、EPLCS XL流式細(xì)胞分析儀（購(gòu)自Becman Coulter公司）等。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1（+）-p27真 核 表 達(dá) 載 體 構(gòu)建 2018年3月1日起，收集HeLa細(xì)胞，收集時(shí)間為其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；收集后進(jìn)行總RNA提取，提取時(shí)可借助Trizol試劑進(jìn)行，以提取的總RNA為模板，然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶與OLiGo20引物合成cDNA，并利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并以試劑盒進(jìn)行純化回收，然后利用25uL TE進(jìn)行溶解備用。利用限制性內(nèi)切酶EcoRI于Xh0I對(duì)純化回收的p27目的片段及真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）進(jìn)行消化，并對(duì)酶切的目的片段、載體進(jìn)行純化回收，然后以3:1方式進(jìn)行鏈接。對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆DH5a進(jìn)行鏈接，然后利用LB瓊脂板篩選，隨機(jī)取單克隆細(xì)菌與體質(zhì)粒DNA行限制性酶切、DNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及p27基因轉(zhuǎn)染、鑒定 將人子宮癌HeLa細(xì)胞株在5% CO2，37 ℃濕化孵箱內(nèi)培養(yǎng)，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pcDNA3.1（+）-p27重組質(zhì)粒導(dǎo)入HeLa細(xì)胞內(nèi)，并利用G418進(jìn)行篩選，并對(duì)pcDNA 3.1質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并以此為對(duì)照。利用免疫印跡法、RT-PCR對(duì)p27高表達(dá)的陽(yáng)性HeLa細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)速率測(cè)定及細(xì)胞周期分析 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并對(duì)其細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，然后在96孔板內(nèi)接種，不同種細(xì)胞分別接種三組，然后置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培育時(shí)間分別控制為1 d、2 d、3 d；然后將培養(yǎng)液完全棄掉，并在每孔內(nèi)加入2 g/L MTT 100 uL，再培養(yǎng)4 h。之后棄盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，并在每孔內(nèi)加入100 uL DMSO振蕩30 min，對(duì)570 nm波長(zhǎng)部位的光吸收值進(jìn)行測(cè)定。然后將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并利用PBS沖洗，并重懸于PBS混合液內(nèi)，并在4 ℃的環(huán)境下固定60 min。之后行離心運(yùn)動(dòng)，然后以PBS混合液進(jìn)行處理，將其轉(zhuǎn)至測(cè)定管中，并以碘化丙錠染液進(jìn)行為期30 min的染色處理，然后以流式細(xì)胞儀行細(xì)胞流式計(jì)數(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p27cDNA克隆及高表達(dá)p27HeLa細(xì)胞株鑒定 本研究成功獲取p27高表達(dá)HeLa細(xì)胞株，且PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳處理可見(jiàn)約600bp部位有一條DNA條帶，而未加模板的空白對(duì)照孔則無(wú)相應(yīng)條帶；并成功構(gòu)建pcDNA3.1（+）-p27真核表達(dá)載體。且經(jīng)免疫印跡法、RT-PCR對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定獲得高表達(dá)p27基因細(xì)胞兩株，以此為L(zhǎng)a-cl、HeLa-c2；轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）細(xì)胞株為HeLa3.1（見(jiàn)圖1）。

圖1 RT-PCR鑒定p27高表達(dá)HeLa細(xì)胞株

2.2 p27高表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響 利用MTT法 對(duì)HeLa、HeLa3.1、La-cl、HeLa-c2四 組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)速度測(cè)定，結(jié)果顯示48 h時(shí)HeLa、HeLa3.1、La-cl、HeLa-c2的生長(zhǎng)速率 分 別 為1.15、1.12、0.75、0.59；HeLa、HeLa3.1的生長(zhǎng)速率明顯高于La-cl、HeLa-c2（P＜0.05）。且經(jīng)流式細(xì)胞分析顯示，高表達(dá)p27基因的HeLaG1期細(xì)胞數(shù)顯著增加，S期細(xì)胞明顯降低，見(jiàn)表1。

表1 p27高表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增周期的影響

3 討 論

子宮頸癌為臨床上發(fā)生率較高的一種腫瘤疾病，對(duì)患者健康及生命安全的威脅極大[3]。而正常細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞周期素均有著不可或缺的作用。細(xì)胞周期素依賴性激酶則在細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用[4]。因此，目前臨床上通常將其作為治療腫瘤關(guān)鍵。

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期素依賴性激酶極易受細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑（CDKIs）等多種因素的影響[5]。故而，臨床上必須要加強(qiáng)對(duì)CDKIs的研究。p27基因?qū)儆诩?xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑的一種，其與多種cyclin-CDK復(fù)合物均可產(chǎn)生一定的作用，從而達(dá)到抑制CDK活性的效果[6]。且研究顯示[7]p27還屬于抑癌基因的一種，其可有效的對(duì)細(xì)胞的分化情況進(jìn)行誘導(dǎo)，有利于促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可對(duì)腫瘤的耐藥性進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)可發(fā)揮防御炎性損傷的功效。且有研究顯示[8]：多種腫瘤疾病患者均伴有程度不一的p27表達(dá)水平下降現(xiàn)象，且患者腫瘤惡性程度和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率通常有較大關(guān)聯(lián)。且臨床研究表明，子宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)p27基因表達(dá)明顯下降，而基因啟動(dòng)子區(qū)則可見(jiàn)甲基化狀態(tài)[9]。因此，本研究中通過(guò)構(gòu)建p27高表達(dá)HeLa細(xì)胞株的方式對(duì)p27基因表達(dá)與子宮頸癌的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示本研究成功獲取p27高表達(dá)HeLa細(xì)胞株，且p27基因高表達(dá)還可發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制功效，并可促使G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加。提示p27基因高表達(dá)可對(duì)HeLa細(xì)胞增殖情況產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，HeLa細(xì)胞中p27基因高表達(dá)可在一定程度上對(duì)細(xì)胞增殖現(xiàn)象進(jìn)行抑制，且p27基因可作為子宮頸癌基因治療的靶基因。