不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

司丙文 徐文財 張小利 郭江鵬 刁其玉 屠 焰**

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；2.北京喬納森科技發(fā)展有限公司，北京 101309；3.北京市植物保護站，北京 100029；4.北京市畜牧總站，北京 100029)

飼料資源短缺是制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一，大力開發(fā)綠色、優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟木本飼料資源對我國畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。構(gòu)樹[Broussonetiapapyrifera(L.)Vent.]又稱楮樹，?？浦参?，雌雄異株的落葉喬木，有的地方稱“皮樹”、“麻葉樹”、“醋桃樹”。雜交育種培育出的雜交構(gòu)樹具有適應性強、耐干冷、耐濕熱、根系發(fā)達、生物量大、耐刈割等特點。構(gòu)樹葉是優(yōu)質(zhì)的飼料原料，研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹葉中粗蛋白質(zhì)含量超過20%[1]，可與苜蓿媲美，富含氨基酸、維生素和微量元素，是一種極具開發(fā)價值的非常規(guī)林業(yè)蛋白質(zhì)飼料資源。構(gòu)樹也是一種傳統(tǒng)中草藥，構(gòu)樹葉中有多種黃酮類化合物、生物堿、多糖、不飽和脂肪酸等活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血壓、增強免疫力、延緩衰老等藥理活性[2]。國務院扶貧辦將構(gòu)樹扶貧工程列入2015年我國十項精準扶貧工程之一。近幾年，我國加大了規(guī)模化推廣雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)力度，“十三五”期間我國雜交構(gòu)樹種植面積將超過500萬hm2。在我國農(nóng)村長期以來就有用構(gòu)樹葉喂養(yǎng)豬、牛、羊的習慣，由于構(gòu)樹葉蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復雜，沒有經(jīng)過生物發(fā)酵處理的構(gòu)樹葉畜禽食用后消化吸收利用率不高[3]。將全株雜交構(gòu)樹粉碎，添加不同添加劑發(fā)酵處理對雜交構(gòu)樹青貯效果的研究報道很少[4]。本文主要探討不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，為促進雜交構(gòu)樹的大規(guī)模種植和綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青貯原料：2017年7月份采自北京市大興區(qū)人工種植的雜交構(gòu)樹，待株高長至1.6 m左右，利用青飼料收獲機進行全株收割粉碎，留茬高度為15～20 cm，粉碎長度1～2 cm，pH 為7.35，其營養(yǎng)組成及微生物組成見表1。

糖蜜：糖蜜為制糖副產(chǎn)品，主要成分為蔗糖，紅褐色黏稠液體，干物質(zhì)含量50.01%，水溶性糖含量65.2%(干物質(zhì)基礎),購于徐州益邦環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

酶菌復合制劑：主要成分為乳酸菌、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，粉末狀,購自寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司。

防腐劑：主要成分為丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺，液態(tài),購自德國愛德康集團。

表1 雜交構(gòu)樹營養(yǎng)組成及微生物組成

FW:鮮重 fresh weight。

1.2 試驗設計與青貯方法

試驗共分5組，各組處理情況見表2。將各組所需青貯劑分別溶于200 mL蒸餾水中，充分攪勻后，均勻噴灑到50 kg原料中，混合均勻，對照組添加等體積蒸餾水。每1 000 g原料裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)中，每個組3個重復，用真空封口機(型號DZ-280/2SD)抽真空封口，室溫貯藏60 d后開封取樣。在制作青貯時，取雜交構(gòu)樹原料樣品，帶回實驗室，-20 ℃保存待檢。

1.3 測定項目及其方法

1.3.1 營養(yǎng)成分分析

青貯飼料于60 ℃烘干48 h，過1 mm篩粉碎。干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量采用AOAC(1995)方法測定。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量采用范氏纖維素方法[5]測定。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)分析

青貯袋開啟后，準確稱取20 g雜交構(gòu)樹青貯，加入180 mL蒸餾水中，用多功能攪拌機勻質(zhì)1 min。勻質(zhì)液用4層紗布過濾，用雷磁PHS-3C精密pH計測定濾液pH[6]。

濾液采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮含量[7]。添加了亞硝酸鈉和六亞甲基四胺的青貯中的氨態(tài)氮含量需要按這些添加劑能產(chǎn)生的最大的氨態(tài)氮潛能來校正[8]。如果用氨態(tài)氮含量占總氮的比例來表示蛋白質(zhì)水解度，未加校正的氨態(tài)氮含量會夸大蛋白質(zhì)的水解度[9]。

可溶性碳水化合物含量采用蒽酮-硫酸法[10]測定。

緩沖能采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[11]測定。

使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀(KC-811色譜柱；柱溫50 ℃；流速1 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量為5 μL)分析乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[12]。

1.3.3 微生物分析

將5 g青貯樣品與45 mL無菌水混勻，在無菌水中做10-1～10-5系列梯度稀釋。使用平板涂布法進行菌落培養(yǎng)。乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上、37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)48 h；酵母與霉菌在PDA培養(yǎng)基上、30 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)24 h；好氧細菌在NA培養(yǎng)基上、30 ℃、好氧條件下培養(yǎng)24 h。以可見菌落數(shù)計[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行ANOVA分析，平均值間差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

表2 試驗設計

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前雜交構(gòu)樹主要營養(yǎng)成分和微生物組成

青貯前雜交構(gòu)樹主要營養(yǎng)成分及表面附著微生物組成見表1，青貯前雜交構(gòu)樹干物質(zhì)、水溶性碳水化合物及粗脂肪含量較低，分別為21.18% FW、4.18% DM和3.05% DM；粗蛋白質(zhì)含量和緩沖能值較高，分別為18.55% DM和502.13 mE/kg DM；構(gòu)樹葉表面附著的乳酸菌為4.51 log (CFU/g FW)，不足5 log (CFU/g FW)，而好氧細菌、酵母和霉菌的數(shù)量相對乳酸菌較多，分別為6.81和5.20 log (CFU/g FW)。

2.2 雜交構(gòu)樹青貯的營養(yǎng)成分

如表3所示，對照組的粗蛋白質(zhì)含量顯著低于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組的干物質(zhì)含量顯著高于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組和MTM組的粗蛋白質(zhì)及粗脂肪含量顯著高于其他3組(P<0.05)，M組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著低于其他各組(P<0.05)，粗灰分含量各組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯營養(yǎng)成分的影響

2.3 雜交構(gòu)樹青貯的發(fā)酵品質(zhì)

如表4所示，對照組pH顯著高于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組的pH最低；與對照組相比，各組的乳酸含量均顯著提高(P<0.05)；M組的乙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；各組均未有丁酸檢出。FFJ組的氨態(tài)氮/總氮顯著低于其他各組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

本試驗中收割的雜交構(gòu)樹株高約1.6 m，枝葉幼嫩，干物質(zhì)含量較低。通常情況下，青貯原料中乳酸菌和水溶性碳水化合物含量越多，越容易青貯成功。一般來說，青貯原料上的乳酸菌數(shù)量至少要達到5 log (CFU/g FW)的水平[14]，才能更好地促進發(fā)酵進程。

表4 不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

雜交構(gòu)樹青貯原料表面附著的乳酸菌數(shù)量為4.51 log (CFU/g FW)，水溶性碳水化合物含量為4.18%，可見雜交構(gòu)樹青貯原料上附生的乳酸菌的數(shù)量較少，干物質(zhì)和水溶性碳水化合物含量低，粗蛋白質(zhì)含量較高，緩沖能高，屬于較難青貯原料。

在本試驗中，M組、TM組及MTM組與對照組相比，pH均有顯著降低，乳酸含量顯著提高，不同程度地提高了發(fā)酵品質(zhì)，各組中乳酸占總酸的比例高于70%，均表現(xiàn)為乳酸發(fā)酵類型，陳雷等[15]在全株玉米全混合日糧中添加乳酸菌顯著改善了發(fā)酵品質(zhì)，同時補充發(fā)酵底物葡萄糖、糖蜜可進一步提高發(fā)酵品質(zhì)。同樣，Li等[16]在王草青貯中添加葡萄糖和糖蜜均顯著降低了pH，提高了乳酸含量。這與Lima等[17]的報道結(jié)果一致，主要是因為糖蜜和酶菌復合制劑的添加直接或間接為乳酸菌提供了更多的發(fā)酵底物或增加了乳酸菌的數(shù)量，從而產(chǎn)生了更多乳酸。

較高的緩沖能及較低的乳酸生成使得對照組的pH下降緩慢，從而未能有效抑制有害菌對蛋白質(zhì)的分解；加之原料本身高含水量和高蛋白質(zhì)含量，造成蛋白質(zhì)分解較強，因此對照組青貯過程中產(chǎn)生的氨態(tài)氮比較多。青貯飼料中氨態(tài)氮主要由植物酶對蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生[18-19]，氨態(tài)氮/總氮反映了青貯飼料蛋白質(zhì)降解的程度。M組、TM組和MTM組均保持較低的氨態(tài)氮/總氮，這可能是由于接種了乳酸菌或增加了發(fā)酵底物，產(chǎn)生更多乳酸，促進了pH下降，進而抑制了青貯過程中植物蛋白酶和微生物對蛋白質(zhì)和氨基酸的降解作用，減少了氨態(tài)氮的產(chǎn)生[20]。

FFJ組青貯中加入丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺組成的混合添加劑，丙酸鈉在酸性條件下產(chǎn)生游離丙酸，丙酸鈉在酸性介質(zhì)中對各類霉菌、好氧芽孢桿菌或革蘭陰性桿菌有較強的抑制作用，六亞甲基四胺可水解為馬尿酸和甲醛，甲醛能使病原體蛋白質(zhì)變性而發(fā)揮非特異性抗菌作用，故FFJ組pH最低，丙酸占總酸的比例最高，蛋白質(zhì)降解少，干物質(zhì)保存最多。陳鵬飛等[9]在光葉紫花苕青貯中加入乳酸菌和由苯甲酸鈉、丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺組成的混合物，降低了pH和氨態(tài)氮的含量，提高了干物質(zhì)含量，這也與Lingvall等[21]的研究結(jié)果一致。

各組青貯中均沒有丁酸檢出，這可能與雜交構(gòu)樹本身富含黃酮類化合物有關。據(jù)報道，每千克構(gòu)樹葉提取物中含273 mg黃酮類物質(zhì)[22]，黃酮類化合物具有很好的抑菌作用，1.0%濃度的構(gòu)樹葉提取物的抑菌和防腐效果優(yōu)于濃度為0.1%的苯甲酸鈉，0.5%濃度及以上均可抑制細菌和霉菌生長，可見構(gòu)樹中含有黃酮類化合物是一種很好的天然防腐劑[23]。

3.2 添加劑對雜交構(gòu)樹青貯營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

青貯干物質(zhì)的損失始于植物細胞的呼吸作用，需氧微生物利用碳源產(chǎn)生水、熱量和二氧化碳，破壞分解養(yǎng)分；在構(gòu)樹青貯中添加丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺，能更快完成pH的下降過程，進而抑制青貯過程中植物蛋白酶和微生物對蛋白質(zhì)和氨基酸的降解作用，減少干物質(zhì)損失，提高蛋白質(zhì)含量，同樣與對照組相比，添加酶菌復合制劑和糖蜜也顯著提高了粗蛋白質(zhì)的含量。董志浩等[24]在桑葉青貯中添加乳酸菌和發(fā)酵底物降低了氨態(tài)氮/總氮，提高了干物質(zhì)含量。同樣，張新平等[25]在苜蓿青貯中添加乳酸菌和纖維素酶，使青貯氨態(tài)氮含量顯著降低,并保存有較多的粗蛋白質(zhì)。

在青貯中添加纖維素酶有助于植物細胞壁的分解，使植物纖維成分含量下降，提高牧草的營養(yǎng)價值。Colombatto等[26]研究了纖維素酶的添加對微生物發(fā)酵的影響，其結(jié)果表明纖維素酶的增加有助于中性洗滌纖維的降解，這與本試驗中M組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量顯著低于對照組一致。也可能是由于較低的pH形成的酸性環(huán)境促進了細胞壁成分的酸解作用。

4 結(jié) 論

本試驗中，在雜交構(gòu)樹青貯中添加糖蜜、酶菌復合制劑及防腐劑，在發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值方面均有明顯的改善；MTM組和FFJ組具有較低的pH，能更好地保存粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)，F(xiàn)FJ組效果最好。從經(jīng)濟角度出發(fā)建議，在雜交構(gòu)樹青貯中添加糖蜜+酶菌復合制劑也能獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料。