富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊小腸黏膜形態(tài)和直腸菌群的影響

程連平 舒迎霜 賀濛初 夏曉冬 李 玉 馮士彬 王希春 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級實驗室，合肥 230036)

近年來，我國養(yǎng)殖場抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增加，造成養(yǎng)殖動物的抗病性降低、畜產(chǎn)品藥物殘留等問題，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。因此，在畜禽生產(chǎn)中開發(fā)綠色安全、高效、無殘留的抗生素替代品已成為研究熱點和必然趨勢。微生態(tài)制劑具有生物拮抗作用，能抑制致病菌的侵入和定植，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及免疫力的提高[2]，目前廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。

湖羊羔羊在斷奶后，由于應(yīng)激反應(yīng)明顯，導(dǎo)致食欲下降、免疫力低下、腹瀉等，影響湖羊的生長發(fā)育。研究表明，飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)畜禽腸道的發(fā)育，并改善腸道菌群[3-4]，但有關(guān)富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊的促生長作用及其機(jī)理未見報道。因此，本試驗以45日齡的湖羊斷奶羔羊為試驗動物，通過在飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌，探討其對小腸黏膜形態(tài)和腸道菌群的影響，為微生態(tài)制劑在反芻動物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與動物

試驗所用枯草芽孢桿菌制劑購自株洲智薈生物科技有限公司，有效活菌數(shù)為1×1010CFU/g；富硒酵母購自安琪酵母有限公司，硒含量為2 000 mg/kg。試驗動物為45日齡湖羊斷奶羔羊，由安徽省馬鞍山市金農(nóng)牧業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

選取21只45日齡體況良好、平均體重為(9.65±0.38) kg的湖羊斷奶羔羊，隨機(jī)分為3組，即對照組、富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組，每組7只羊。試驗期28 d。參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[5]配制基礎(chǔ)飼糧(由安徽省馬鞍山市金農(nóng)牧業(yè)有限公司提供)，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別按照100 g/t的比例在精料中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌制劑。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following: VA 120 000 IU，VD360 000 IU，VE 1 900 mg，煙酸 niacin 360 mg，Zn 1.8 g，Cu 0.22 g，Mn 2.0 g，Ca 150 g，P 15 g，NaCl 75 g。2)代謝能、鈣、磷為計算值，其他營養(yǎng)水平為實測值。ME, Ca and P were calculated values, while the other nutrient levels were measured values.

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在安徽省馬鞍山市金農(nóng)牧業(yè)有限公司羊場進(jìn)行，在預(yù)試時免疫注射三聯(lián)四防疫苗，并注射伊維菌素溶液(0.2 mg/kg)進(jìn)行驅(qū)蟲處理。每天根據(jù)前1天料盆內(nèi)剩余料重調(diào)整飼喂量，保證其自由采食和飲水。

1.4 樣品采集

在試驗的第28天，每組隨機(jī)解剖3只羔羊。將小腸各段結(jié)合處用細(xì)線扎緊，以防污染樣品，依次剪取十二指腸、空腸和回腸，并將小腸各段放入4%多聚甲醛固定液，用于蘇木素-伊紅(HE)染色檢測腸道黏膜形態(tài)。

在無菌的條件下，將直腸內(nèi)容物放于10 mL滅菌離心管中，凍存于-80 ℃冰箱保存。

1.5 小腸組織形態(tài)學(xué)測定

從十二指腸、空腸、回腸中間截取2 cm腸段，常規(guī)酒精脫水，石蠟切片后包埋，切片厚度5 μm，經(jīng)HE染色后，樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，比較小腸絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)。每段小腸各取5張HE染色切片，每張切片選5個視野，數(shù)碼拍照，應(yīng)用Image pro-Plus 6.0圖像處理軟件在每張照片中測量5根最長的腸絨毛高度(以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準(zhǔn))、最深的隱窩深度(以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準(zhǔn))，并且計算絨毛高度與隱窩深度比值(V/C)。

1.6 腸道菌群的高通量測序

每組分別選取3份直腸內(nèi)容物樣品,稱取0.2 g，采用DNA提取試劑盒提取DNA，樣品濃度通過Qubit分光光度計檢測。根據(jù)16S rDNA基因的V4區(qū)保守序列設(shè)計通用引物：上游引物是5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，下游引物是5′-GGACTACHVGGGTWTCTATT-3′。PCR體系(50 μL)為：5 μL 10×Buffer A，1 μL 10 mmol/L dNTP，4 μL PCR Primer Cocktail，2 μL Primer F，0.2 μL KAPA Taq，25 μL PCR Master Mix，30 ng DNA和12.8 μL ddH2O。PCR程序為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃保溫7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒測序文庫。高通量測序文庫的構(gòu)建和基于Illumina MiSeq平臺的測序由深圳華大基因科技有限公司完成。

16S rDNA測序分析采用QIIME進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控后的序列按照97%的相似性分別聚到1個操作分類單元(OTU)。將具有代表性的序列系統(tǒng)分類到門、綱、目、科、屬、種的水平。豐富度和α多樣性分析包括Sobs、Chao1、Ace、Shannon和Simpson指數(shù)和覆蓋率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，多組之間的比較采用單因素方差分析和多重比較法，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊小腸黏膜形態(tài)的影響

由表2可知，與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組的十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度顯著提高(P<0.05)，十二指腸和回腸的隱窩深度顯著降低(P<0.05)，空腸的隱窩深度極顯著降低(P<0.01)，十二指腸和空腸的V/C極顯著提高(P<0.01)，回腸的V/C顯著提高(P<0.05)。

2.2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊直腸菌群的影響

2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析結(jié)果

由表3可知，分析本試驗中所采集的9個樣品，共得到483 860條Tags，相關(guān)Tags共計達(dá)482 164條，所有樣品的有效拼接比例均在99%以上，這說明本試驗數(shù)據(jù)的可靠性較強(qiáng)。

表2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊小腸黏膜形態(tài)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。表5至表9同。In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Table 5 to Table 9.

表3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.2.2 樣品OTU數(shù)量及α多樣性分析

選取樣品中最少的Tags條數(shù)，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，統(tǒng)計每個樣品在每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。通過表4得出，9個樣品進(jìn)行OTU聚類分析共產(chǎn)生4 065個OTU。對照組1 330個，富硒酵母組1 580個，枯草芽孢桿菌組1 155個，這說明各組間菌群豐度存在差異，富硒酵母組菌群豐富程度最高。

在97%的相似度下，得到了每個樣品的OUT數(shù)量，利用Venn圖可以展示多樣品共有和各自特有OTU數(shù)量，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。將樣品數(shù)據(jù)混合后，3個組在種水平上細(xì)菌的群落組成如圖1所示，3個樣品一共含有不重復(fù)的細(xì)菌726種，其中富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組共同擁有488種細(xì)菌，富硒酵母組和對照組共同擁有554種細(xì)菌，枯草芽孢桿菌組和對照組共同擁有482種細(xì)菌。

α多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)，Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)。前面4個指數(shù)越大，最后1個指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。由表4可知，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組Simpson指數(shù)低于對照組，說明富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組腸道菌群多樣性高于對照組。此外，所有樣品的覆蓋率約等于1.00%，表明樣品中未被檢測到的可能性較低。

表4 樣品α多樣性分析及樣品OTU統(tǒng)計

樣品名稱：Sel、Bac、Con。

2.2.3 物種累積曲線及OTU Rank曲線分析

物種累積曲線用于描述隨著抽樣量的加大物種增加的情況，被廣泛用于抽樣量充分性的判斷以及物種豐富度的估計。微生物OTU Rank曲線能夠展現(xiàn)樣品中物種多樣性。

由圖2看出，隨機(jī)抽到的序列數(shù)與觀測到的OTU數(shù)量構(gòu)建的物種累計曲線分析得出，樣品曲線逐漸趨于平緩，說明有效測序數(shù)量已經(jīng)能夠較好地覆蓋所有試驗羔羊腸道菌種的多樣性。對各樣品的OTU豐度大小排序后，由圖3看出所有樣品中物種的OTU Rank曲線縱軸的形狀逐漸平坦，由此看出，試驗中樣品的物種分布均勻，可用于多樣性分析，可以為后續(xù)的樣品分析提供基礎(chǔ)。

圖2 物種累計曲線圖

圖3 OTU Rank曲線圖

2.2.4 物種注釋分析

通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對OTU進(jìn)行物種分

類，并分別在門、綱、目、科、屬、種分類水平上對各個樣品進(jìn)行物種分析。

圖4直觀反映了不同門水平物種在每個樣品中的相對豐度。由圖4中得出，9個樣品中分布最多的是厚壁菌門(Firmicutes)，其次是放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)，說明這4種門水平的細(xì)菌是湖羊羔羊直腸的優(yōu)勢菌群。

由表5可知，與對照組相比發(fā)現(xiàn)，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組放線菌綱(Actinobacteria)相對豐度顯著增加(P<0.05)，梭菌綱(Clostridia)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)相對豐度顯著降低(P<0.05)，產(chǎn)芽胞菌綱(Erysipelotrichi)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)和ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)相對豐度差異不顯著(P>0.05)，但有升高的趨勢。

由表6可知，在每個樣品中雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)、梭菌目(Clostridiales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和紅椿桿菌目(Coriobacteriales)所占的比例較多。與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組雙歧桿菌目、甲烷桿菌目和紅椿桿菌目相對豐度顯著提高(P<0.05)，梭菌目相對豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 樣品門分類水平中物種分布柱狀圖

表6 腸道微生物在目水平的物種相對豐度顯著性分析

由表7可知，在每個樣品中雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)所占的比例較多。與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組的雙歧桿菌科和丹毒絲菌科相對豐度顯著提高(P<0.05)，瘤胃球菌科相對豐度顯著降低(P<0.05)；富硒酵母組毛螺菌科和甲烷桿菌科相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表7 腸道微生物在科水平的物種豐度顯著性分析

由表8可知，與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、布雷德菌屬(Bulleidia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度顯著增加(P<0.05)，顫螺旋菌屬(Oscillospira)、梭菌屬(Clostridium)、糞球菌屬(Coprococcus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)相對豐度顯著降低(P<0.05)；富硒酵母組巨型球菌屬(Megasphaera)相對豐度顯著升高(P<0.05)；枯草芽孢桿組丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacte)相對豐度顯著升高(P<0.05)。

表8 腸道微生物在屬水平的物種豐度顯著性分析

由表9可知，與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組Sharpea_azabuensi相對豐度顯著提高(P<0.05)，Bacteroides_ovatus、Bacteroides_uniformis、Clostridium_hathewayi、Coprococcus_catus相對豐度顯著降低(P<0.05)；枯草芽孢桿菌組Lactobacillus_acidipiscis相對豐度顯著提高(P<0.05)。

3 討 論

3.1 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對小腸黏膜形態(tài)的影響

小腸是動物進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要器官，小腸黏膜的發(fā)育程度不僅和動物機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)攝入息息相關(guān)，而且也參與腸道黏膜免疫反應(yīng)[6]。小腸絨毛高度、隱窩深度及V/C是衡量小腸吸收功能的重要指標(biāo)[7]。有研究證明，在育肥豬飼糧中添加酵母菌能夠顯著促進(jìn)十二指腸的發(fā)育[8]。Yunusova等[9]研究表明，在母羊飼糧中添加富硒酵母，發(fā)現(xiàn)對分娩后產(chǎn)出羔羊的空腸腸道發(fā)育有顯著的促進(jìn)作用。齊博等[10]認(rèn)為，枯草芽孢桿菌可顯著提高肉仔雞十二指腸絨毛高度和V/C。Mahmoud等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以顯著增加空腸隱窩深度。祁鳳華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在1日齡健康肉雞飼糧中添加0.1%枯草芽孢桿菌，能顯著提高十二指腸絨毛高度和V/C。周勃[13]的研究也表明，在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌，能顯著提高小腸各段絨毛高度、V/C、黏膜厚度及肌層厚度。從本試驗結(jié)果看，在湖羊羔羊飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌顯著提高了十二指腸、空腸、回腸的絨毛高顯，顯著降低了十二指腸和回腸的隱窩深度，極顯著提高了十二指腸和空腸的V/C，說明富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊的小腸各段的發(fā)育有顯著的促進(jìn)作用。

3.2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對直腸菌群的影響

動物腸道中的菌群可以為宿主消化代謝營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腸道的發(fā)育，同時抵御病原體，參與機(jī)體相關(guān)免疫功能的發(fā)揮[14]。Lv等[15]研究在仔豬飼糧中添加富硒酵母對高溫環(huán)境下腸道微生態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌含量極顯著提高。Li等[16]研究結(jié)果表明，酵母菌能增加大鼠腸道微生物數(shù)量和多樣性，改善腸道免疫功能。劉紅露等[17]研究酵母硒對肉雞腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)面包酵母硒不但可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，而且能改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)在紹興鴨飼糧中添加枯草芽孢桿菌后，盲腸菌群的數(shù)量顯著增加，說明枯草芽孢桿菌能夠顯著改善紹興鴨的腸道微生物區(qū)系。鄭婷婷等[19]研究報道，從土壤中分離的枯草芽孢子桿菌顯著提高肉雞腸道消化球菌、雙歧桿菌、乳酸菌以及總厭氧菌群的數(shù)量。Wu等[20]研究證實，在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌后，腸道乳酸桿菌的數(shù)量顯著提高，大腸桿菌數(shù)量顯著減少，說明枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)腸道中有益菌群的增殖，降低有害菌群的數(shù)量。吳志新等[21]研究指出，枯草芽孢桿菌能夠顯著增加草魚腸道中芽孢桿菌的比例和厭氧菌總數(shù)、雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量。任繼平[22]研究指出，不同劑量的芽孢桿菌制劑都能顯著提高盲腸或結(jié)腸中乳酸桿菌數(shù)量。從本試驗結(jié)果看，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組中放線菌綱相對豐度顯著增加，雙歧桿菌目、甲烷桿菌目和紅椿桿菌目相對豐度顯著提高，雙歧桿菌科和丹毒絲菌科相對豐度顯著提高。有研究表明，雙岐桿菌和乳桿菌能夠酵解碳水化合物，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低腸道內(nèi)環(huán)境pH，抑制病原菌的生長入侵，從而保護(hù)腸黏膜屏障，提高宿主的免疫機(jī)能[23-24]。Kociolek等[25]研究證實，梭菌可產(chǎn)生外毒素，對人和動物都有較強(qiáng)的毒害作用。本試驗中富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組直腸中梭菌目相對豐度顯著降低。因此，本試驗結(jié)果說明富硒酵母和枯草芽孢桿菌能增加有益菌群的數(shù)量，抑制有害菌群的增殖，從而改善直腸腸道微生態(tài)，促進(jìn)羔羊的消化功能，提高機(jī)體免疫力。

4 結(jié) 論

在飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠顯著提高湖羊羔羊的小腸絨毛高度、V/C，促進(jìn)小腸各段的發(fā)育。富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠增加直腸有益菌群的豐度，抑制有害菌群的增殖，提高羔羊機(jī)體的免疫力。