羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)和腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

楊廣達(dá) 王 麗 易宏波 王志林 楊雪芬 高開(kāi)國(guó) 溫曉鹿 蔣宗勇*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

斷奶常常會(huì)使仔豬面臨環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)等方面的應(yīng)激，伴隨著仔豬胃腸道生理、微生物和免疫的巨大改變,表現(xiàn)為采食量降低、體重減少、飼料消化能力降低等[1]。過(guò)去常常運(yùn)用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑來(lái)克服此類(lèi)問(wèn)題和減少經(jīng)濟(jì)損失。然而，大量使用抗生素會(huì)帶來(lái)藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等負(fù)面影響，禁抗或限抗已勢(shì)在必行，因此，尋找抗生素替代物成為養(yǎng)殖業(yè)的迫切任務(wù)。益生菌制劑是公認(rèn)的比較有效的抗生素替代物的選擇之一，是一類(lèi)當(dāng)攝入足夠量時(shí)對(duì)宿主有益的活性微生物[2]。大量研究表明，在仔豬飼糧中添加益生菌能提高仔豬生長(zhǎng)性能(提高仔豬平均日增重、平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率等)[3]，可以推測(cè)，益生菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收方面有促進(jìn)作用。一方面，益生菌可提高仔豬或生長(zhǎng)豬氮(N)全消化道表觀消化率(ATTD)[4]和粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷等幾大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[5]；另一方面，益生菌又可通過(guò)提高腸道消化酶的活性來(lái)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[6]。但是，益生菌在體內(nèi)通過(guò)何種分子機(jī)制促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝鮮有報(bào)道。本課題前期的試驗(yàn)表明，羅伊氏乳桿菌LR1(L.reuteriLR1)可提高仔豬斷奶后1～14 d的生長(zhǎng)性能[7]，因此，我們假設(shè)，羅伊氏乳桿菌可能通過(guò)促進(jìn)仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，從而加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)擬研究羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)腸道中胃腸激素、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝過(guò)程中合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體和關(guān)鍵酶的調(diào)控作用，來(lái)探討羅伊氏乳桿菌對(duì)仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收功能的影響，以期為羅伊氏乳桿菌在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用益生菌制劑為羅伊氏乳桿菌LR1，前期由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所分離篩選并鑒定，符合作為豬益生菌飼料添加劑的條件[8]。羅伊氏乳桿菌LR1經(jīng)噴霧干燥制成粉劑，以便后期在飼糧中混合。本試驗(yàn)所用抗生素為喹乙醇(olaquindox)和金霉素(aureomycin)，有效成分含量分別為50%和20%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取144頭杜×長(zhǎng)×大21日齡斷奶仔豬[初始體重為(6.49± 0.01) kg],隨機(jī)分配至3個(gè)組：對(duì)照組(CON)，飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組(OA)，飼喂基礎(chǔ)飼糧+100 mg/kg喹乙醇+75 mg/kg金霉素；羅伊氏乳桿菌組(LR1)，飼喂基礎(chǔ)飼糧+5.0×1010CFU/kg羅伊氏乳桿菌LR1。每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭仔豬，試驗(yàn)期為14 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)中7～11 kg生長(zhǎng)階段豬推薦營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，基礎(chǔ)飼糧制成粉料。試驗(yàn)地點(diǎn)位于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所試驗(yàn)場(chǎng)，欄舍為全封閉建筑帶有溫控裝置，仔豬圈養(yǎng)于離地的漏縫欄，配備飲水頭和可控流量喂料器，以便仔豬自由采食和飲水。各組仔豬按一致的免疫程序進(jìn)行疫苗接種、保健等。

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content有效磷 AP0.39賴(lài)氨酸 Lys1.57蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.89蘇氨酸 Thr0.97色氨酸 Try0.26

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provides following per kg of the diet:VA 12 400 IU，VD32 800 IU，VE 200 IU，VK35 mg，VB1240 μg，VB13 mg，VB210 mg，煙酸 niacin 40 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg，葉酸 folic acid 1 mg，VB68 mg，生物素 biotin 0.08 mg，F(xiàn)e (FeSO4·H2O) 120 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 16 mg，Mn (MnSO4·H2O) 70 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 120 mg，I (CaI2O6) 0.7 mg，Se (Na2SeO3) 0.48 mg。2)除粗蛋白質(zhì)、鈣、總磷為實(shí)測(cè)值外，其余營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values except the CP, Ca and TP were measured values.

1.4 樣品采集

試驗(yàn)第14天08:00，從每個(gè)組的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭仔豬，前腔靜脈采血5 mL后分離血清，保存于-20 ℃冰箱，用于血清生化指標(biāo)測(cè)定；麻醉后完全放血處死，剖開(kāi)腹腔，完整取出消化道，分離內(nèi)臟，用細(xì)線按解剖學(xué)理論將小腸分為十二指腸、空腸和回腸；取上述中段腸段約2 cm，用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內(nèi)容物，用濾紙吸干水分后置于無(wú)菌EP管，液氮速凍，其后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 血清生化指標(biāo)

測(cè)定血清中白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總蛋白(TP)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)的含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性。上述血生化清指標(biāo)采用試劑盒法檢測(cè)，按照試劑盒附帶方法進(jìn)行。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃腸激素和腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)

1.5.2.1 腸道組織總RNA提取和cDNA合成

將-80 ℃保存的各腸段放于預(yù)先滅菌的研缽中，加入液氮后研磨成粉末狀。取適量粉末至無(wú)菌EP管中，用Trizol法提取腸道組織總RNA，然后將總RNA用試劑盒法(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋成適當(dāng)濃度即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。

1.5.2.2 qPCR引物設(shè)計(jì)

在NCBI上獲取目的基因序列，運(yùn)用Prime Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列及其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 qPCR引物參數(shù)

續(xù)表2基因Genes登錄號(hào)Accession No.引物序列Primer sequences (5'—3')產(chǎn)物大小Product size/bpPPARγNM_214379.1F:GCTGGCCTCCTTGATGAATAR:CTCGAACTTGGGCTCCATAA121ASCT2XM_003127238.5F:CTGGTCTCCTGGATCATGTGGR:CAGGAAGCGGTAGGGGTTTT146y+LAT1NM_001110421.1F:GAGTGCCAGAACACAAACGAR:TCCTCCATCTTCCAAATCCA216rBATNM_001123042.1F:CTACCAGGTCTACCCTCGTTCR:TTCCCATAGACACTCACCCA414CAT1NM_001012613F:CATCAAAAACTGGCAGCTCAR:TGGTAGCGATGCAGTCAAAG185mTORXM_003127584F:AGCCCATAAGAAAACGGGGAR:AAAGGACACCAGCCGATGTA246PepT1NM_214347.1F:GGTTTAGGCATCGGAGTAAGAAGTR:GGTCAAACAAAGCCCAGAACAT156GLUT2NM_001097417.1F:GCACATCCTGCTTGGTCTATCTR:CACTTGATGCTTCTTCCCTTTC203GLUT4NM_001128433.1F:AGGCACCCTCACTACCCTCTR:CTTCTTCCTTCCCAGCCACT109SGLT1XM_021072101.1F:TCATCATCGTCCTGGTCGTCTCR:CTTCTGGGGCTTCTTGAATGTC144SGLT3NM_014227.2F:ATACATCAAGGCAGGGGTGAR:CGCCAGATAAAGGTCCAATC184β-ACTBXM_003124280.4F:CACGCCATCCTGCGTCTGGAR:AGCACCGTGTTGGCGTAGAG380GAPDHNM_001206359.1F:ACTCACTCTTCCACTTTTGATGCTR:TGTTGCTGTAGCCAAATTCA100

CCK：膽囊收縮素 cholecystokinin；MLN:胃動(dòng)素 motilin；I-FABP:小腸脂肪酸結(jié)合蛋白 intestinal fatty acid binding protein；FABP3:脂肪酸結(jié)合蛋白3 fatty acid binding protein 3；ACCα:乙酰輔酶A羧化酶α acetyl CoA carboxylase α；FASN:脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；SREBP1：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element-binding protein 1；PPARγ：過(guò)氧化物體增殖物激活受體γ peroxisome proliferator-activated receptor γ；ASCT2：Na+依賴(lài)性谷氨酰胺載體2 Na+dependent glutamine transporter 2；y+LAT1：y+L氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1 y+L amino acid transporter 1；rBAT：中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 neutral and basic amino acid transport protein；GLUT：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 glucose transporter；SGLT：鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體 sodium-dependent glucose transporter；CAT1：陽(yáng)離子氨基酸運(yùn)載體1 cationic amino acid transporter 1；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；PepT1：小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1 peptide transporter 1；β-ACTB：肌動(dòng)蛋白 β-actin；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。

1.5.2.3 qPCR體系組成和程序設(shè)定

qPCR反應(yīng)體系組成：總體積10 μL，其中iTaq Universal SYBR Green Supermix為5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板4 μL。每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)孔。

擴(kuò)增程序設(shè)定：95.0 ℃預(yù)變性30 s; 95.0 ℃變性15 s；退火30 s；72.0 ℃延伸30 s；40個(gè)循環(huán)，之后進(jìn)行熔解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以最小顯著性差異(LSD)法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)。

2 結(jié) 果

2.1 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

從表3可以看出，試驗(yàn)第14天，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗生素可顯著升高血清中葡萄糖含量而顯著降低尿素氮含量(P<0.05)，對(duì)其他血清生化指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)；飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)血清生化指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)，但有降低尿素氮含量的趨勢(shì)，使尿素氮含量降低29.11%(P>0.05)。

表3 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道胃腸激素mRNA表達(dá)的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著提高了空腸膽囊收縮素(CCK)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但顯著降低了回腸CCK的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；與抗生素組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著提高了十二指腸CCK的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1和抗生素都可顯著提高十二指腸胃動(dòng)素(MLN)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，且添加抗生素還可顯著降低空腸MLN的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體和關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響

由圖2可以看出，與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著提高了十二指腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體Na+依賴(lài)性谷氨酰胺載體2(ASCT2)、陽(yáng)離子氨基酸運(yùn)載體1(CAT1)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(PepT1)和空腸中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(rBAT)以及空腸與回腸y+L氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(y+LAT1)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但顯著降低了十二指腸y+LAT1和回腸CAT1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加抗生素提高了空腸y+LAT1、CAT1、PepT1以及空腸與回腸哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了十二指腸和回腸PepT1、空腸ASCT2的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

關(guān)于腸道脂肪酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)載體和關(guān)鍵酶，由圖3可以看出,與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1可顯著提高十二指腸小腸脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)、乙酰輔酶A羧化酶α(ACCα)、脂肪酸合成酶(FASN)和十二指腸與空腸脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)以及十二指腸、空腸與回腸過(guò)氧化物體增殖物激活受體γ(PPARγ)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但顯著降低了空腸I-FABP和回腸FABP3、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加抗生素顯著提高了空腸ACCα的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但顯著降低了回腸FABP3和SREBP1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

如圖4所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1可顯著提高空腸和回腸鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(SGLT1)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，飼糧添加抗生素則顯著提高了十二指腸SGLT1、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(SGLT3)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。但是，與對(duì)照組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著降低了空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT2)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)飼糧添加抗生素顯著降低了十二指腸GLUT2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)以及回腸GLUT2的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

圖2 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

圖3 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道脂肪酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)載體和關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)通常被用來(lái)反映體內(nèi)器官功能和新陳代謝的變化情況，例如，血清總蛋白含量可在一定程度上反映機(jī)體對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的利用情況，球蛋白含量可反映體內(nèi)的抗體水平[9]；尿素氮作為蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物之一，其含量可反映蛋白質(zhì)利用效率或氨基酸的平衡狀態(tài)，若血清尿素氮含量較低，表明氮的利用率較高，蛋白質(zhì)合成代謝旺盛，而分解代謝弱，對(duì)蛋白質(zhì)沉積有利[10]。本研究中，飼糧添加抗生素能使血清尿素氮含量顯著降低，此外，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1也能使血清尿素氮含量在一定程度上降低，表明仔豬體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成代謝大于分解代謝，蛋白質(zhì)獲得沉積。這個(gè)結(jié)果部分解釋了動(dòng)物試驗(yàn)中羅伊氏乳桿菌組和抗生素組仔豬平均日增重獲得提高的結(jié)果。血清葡萄糖的兩大來(lái)源為腸道吸收和肝糖原的分解，而禁食情況下葡萄糖來(lái)源主要依靠后者。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加抗生素能顯著提高禁食情況下血清葡萄糖含量，表明該組仔豬具有更高的能量代謝水平，可能與仔豬試驗(yàn)期內(nèi)采食量顯著增加有關(guān)；此外，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)血清葡萄糖含量也有一定的提高，但差異不顯著，以上結(jié)果與Zhou等[9]的報(bào)道相似。

3.2 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道胃腸激素的影響

CCK是一種多肽激素，由胃腸道黏膜Ⅰ型細(xì)胞分泌，具有收縮膽囊和促進(jìn)胰臟消化酶分泌的作用[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌LR1可提高空腸CCKmRNA的表達(dá)，此外，與抗生素組相比，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1能顯著提高十二指腸CCKmRNA的表達(dá)，可能引起更多膽汁和胰腺消化酶的釋放，表明羅伊氏乳桿菌LR1比抗生素具有更強(qiáng)的促化學(xué)消化能力，可能是羅伊氏乳桿菌LR1發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所致。

圖4 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

MLN是由小腸前段嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生的一種激素，可刺激胃腸道的蠕動(dòng)，特別是胃竇和十二指腸前段，參與消化間期腸道運(yùn)動(dòng)。研究表明，MLN與動(dòng)物的采食調(diào)節(jié)有關(guān)，還參與了消化間期胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1或抗生素均可顯著提高十二指腸MLNmRNA的表達(dá)，說(shuō)明這兩者都可以促進(jìn)胃腸道的蠕動(dòng)和分節(jié)運(yùn)動(dòng)，即促進(jìn)了物理性消化，提高了腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率。

3.3 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和脂肪進(jìn)入小腸后被分別分解為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的游離氨基酸、單糖和脂肪酸，由相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或其他形式吸收進(jìn)入細(xì)胞以供機(jī)體利用[13]。本研究前期動(dòng)物試驗(yàn)表明，羅伊氏乳桿菌LR1可提高斷奶仔豬的平均日增重(提高22.73%)，與抗生素的作用相似(平均日增重提高29.63%)，改善了仔豬的生長(zhǎng)性能[7]。因此我們推測(cè)，羅伊氏乳桿菌LR1可能通過(guò)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA的表達(dá),從而改善腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能。研究表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)可促進(jìn)豬上皮細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1和CAT1的表達(dá)[14]。周響艷[15]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌能顯著提高豬十二指腸b0,+氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(b0,+AT)和y+LAT1 mRNA的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著提高了十二指腸ASCT2、CAT1、PepT1和空腸rBAT以及空腸與回腸y+LAT1 mRNA的表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，且與抗生素的作用相似，表明羅伊氏乳桿菌LR1可能促進(jìn)氨基酸的吸收。但是，飼糧添加羅伊氏乳桿菌LR1顯著降低了十二指腸y+LAT1和回腸CAT1 mRNA的表達(dá)，可能由于CAT1 mRNA的表達(dá)量在不同腸段存在差異，也可能與腸腔中的氨基酸濃度和需要水平有關(guān)[16]。然而，有關(guān)羅伊氏乳桿菌LR1如何調(diào)節(jié)腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

3.4 羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)斷奶仔豬腸道脂肪酸合成的影響

飼糧脂肪主要由甘油三酯(TG)組成，TG在腸道內(nèi)被消化為脂肪酸和甘油單酯，然后被腸上皮細(xì)胞吸收并重新合成TG，TG被包裝成乳糜微粒，運(yùn)輸?shù)酵庵芙M織以供利用[17]。脂肪合成發(fā)生于胞漿中，涉及很多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或關(guān)鍵酶，例如，脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)可催化腸道游離脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞，ACCα則是脂肪酸合成第1階段的限速酶，而FASN則是催化脂肪鏈合成的關(guān)鍵酶。本研究顯示，羅伊氏乳桿菌LR1能顯著上調(diào)十二指腸I-FABP、FABP3和空腸FABP3 mRNA的表達(dá)，以參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。前人報(bào)道，芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能使豬皮下脂肪組織中ACCα和FASN的mRNA表達(dá)上調(diào)[18]，在本研究中也發(fā)現(xiàn)二者的mRNA表達(dá)量在羅伊氏乳桿菌LR1組仔豬十二指腸中被顯著提高，與上述研究一致，說(shuō)明羅伊氏乳桿菌LR1可促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)脂肪酸從頭合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而加快腸道脂肪酸合成。

SREBP1和PPARγ是重要的調(diào)控脂肪酸合成的轉(zhuǎn)錄因子和核轉(zhuǎn)錄基因[19]。研究發(fā)現(xiàn)，約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)可提高肉雞肝臟PPARγmRNA的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)mRNA表達(dá)量被下調(diào)[20]。本研究結(jié)果類(lèi)似于此，羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)小腸3個(gè)腸段的PPARγmRNA的表達(dá)都有顯著提高的作用，而SREBP1 mRNA的表達(dá)量在各組小腸前段沒(méi)有顯著差異，在回腸其mRNA表達(dá)量被降低。因此，我們推測(cè)PPARγ是羅伊氏乳桿菌組仔豬腸道脂肪酸合成最重要的調(diào)控因子。

小腸組織對(duì)飼糧中脂肪含量的適應(yīng)性反映在其對(duì)脂肪吸收能力的變化，尤其是通過(guò)脂肪結(jié)合蛋白的協(xié)同誘導(dǎo)[21]。脂肪的消化吸收多數(shù)發(fā)生于小腸前部[13]。因此，前文提到，羅伊氏乳桿菌LR1提高了CCK的mRNA表達(dá)量，引起膽囊收縮并釋放膽汁、胰腺釋放消化酶。經(jīng)過(guò)小腸前段的脂肪被膽汁(膽鹽)乳化為乳糜微粒，也被胰腺所分泌的脂肪酶消化為脂肪酸等產(chǎn)物。因此，為了適應(yīng)腸道中脂肪酸含量的提高，小腸前段負(fù)責(zé)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的I-FABP、FABP3的mRNA表達(dá)量提高，更多的脂肪酸進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，在PPARγ調(diào)控下和ACCα、FASN等關(guān)鍵酶參與下進(jìn)行TG合成。同樣，小腸后段對(duì)腸道脂肪酸的變少產(chǎn)生適應(yīng)，因此我們觀察到，羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)仔豬回腸脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響不大，甚至出現(xiàn)負(fù)調(diào)控。本研究結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌LR1也對(duì)仔豬腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生一定影響。Faseleh等[22]的研究顯示乳酸菌可使肉雞腸道GLUT2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體5(GLUT5)、SGLT1、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(SGLT4)等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)上調(diào)，也有研究表明用植物乳桿菌預(yù)處理后進(jìn)行大腸桿菌攻毒的豬腸道上皮細(xì)胞中SGLT1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)[14]。本研究中，羅伊氏乳桿菌LR1提高了空腸和回腸SGLT1 mRNA的表達(dá)，但降低了GLUT2 mRNA在空腸的表達(dá)，與上述研究部分不同，可能由于試驗(yàn)所用菌株和試驗(yàn)對(duì)象不同造成的。

mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞調(diào)控蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用[23]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗生素使空回腸mTOR的表達(dá)上調(diào)，表明抗生素可能通過(guò)促進(jìn)mTOR信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，其機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)十二指腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT1、SGLT3 mRNA的表達(dá)有促進(jìn)作用；此外，抗生素提高了空腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1、CAT1、PepT1 mRNA的表達(dá)。研究表明，在仔豬飼糧中添加恩拉霉素可以促進(jìn)仔豬腸道SGLT1和PepT1 mRNA的表達(dá)[24]，結(jié)果與本研究一致，提示抗生素可促進(jìn)空腸小肽和氨基酸的吸收。

正常的腸黏膜結(jié)構(gòu)是腸道發(fā)揮正常消化吸收功能的前提條件之一。一般認(rèn)為，腸黏膜絨毛高度增加與表面積增大可使小腸上的轉(zhuǎn)運(yùn)載體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積增大，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[25]。本試驗(yàn)前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌LR1改善了仔豬腸道形態(tài)，表現(xiàn)為更高的回腸絨毛高度以及空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度比值[7]。周響艷[15]的研究認(rèn)為，乳酸菌改善小腸絨毛生長(zhǎng)狀況的作用與乳酸菌對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。另?yè)?jù)研究表明，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的上調(diào)可能有助于腸道形態(tài)的完整及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而有利于動(dòng)物生長(zhǎng)[26]。因此，羅伊氏乳桿菌LR1對(duì)仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的調(diào)控作用從另一方面證實(shí)羅伊氏乳桿菌LR1改善了腸道黏膜形態(tài)的作用，進(jìn)而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加5.0×1010CFU/kg羅伊氏乳桿菌LR1可促進(jìn)斷奶仔豬腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力。

② 羅伊氏乳桿菌LR1和抗生素對(duì)仔豬腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)有相似的調(diào)控作用，可促進(jìn)氨基酸吸收和脂肪酸合成，因此，羅伊氏乳桿菌LR1可考慮作為抗生素替代物以改善仔豬生長(zhǎng)性能。