米曲霉來源α-半乳糖苷酶基因gal A在畢赤酵母中的表達(dá)及其對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

郭昱含 楊勇智 郭賀楠 王 劍 曹云鶴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

大豆、大豆產(chǎn)品及大豆加工副產(chǎn)品是人及動(dòng)物重要的蛋白質(zhì)來源，在食品和飼料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。大豆中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制劑、植酸、單寧和大豆寡糖等[1-2]，其中大豆寡糖中的棉籽糖和水蘇糖等α-半乳糖苷類寡糖，由于人和單胃動(dòng)物體內(nèi)缺少相應(yīng)的水解酶α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC 3.2.1.22)，這些寡糖只能在后腸段被微生物發(fā)酵，這一過程中會(huì)產(chǎn)生CO2和甲烷等氣體，造成脹氣、腹痛、惡心和腹瀉等胃腸不適，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，對(duì)人體健康和動(dòng)物的生產(chǎn)性能造成負(fù)面影響。用α-半乳糖苷酶酶解是消除大豆寡糖抗?fàn)I養(yǎng)因子的常用方法之一。

α-半乳糖苷酶又稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，能特異性水解α-半乳糖苷末端非還原性的α-1,6-半乳糖殘基，其可作用于含半乳糖的低聚寡糖如蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等，還可以作用于含半乳糖的多聚糖如半乳甘露聚糖和半乳糖脂等。α-半乳糖苷酶分布廣泛，咖啡豆等豆科植物的種子、番茄和煙草中均可分離得到α-半乳糖苷酶[3-5]，嗜熱細(xì)菌HB27、巨大芽孢桿菌、熱解纖維素菌、脆弱類桿菌、假交替單胞菌和天藍(lán)色鏈霉菌等細(xì)菌[6-11]，尖孢鐮刀菌、雙孢蘑菇、榆黃蘑和里氏木霉等真菌[12-15]以及人和鼠等哺乳動(dòng)物[16-17]中也能分離得到α-半乳糖苷酶。

α-半乳糖苷酶在醫(yī)療、飼料、食品和造紙等行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)療領(lǐng)域中，α-半乳糖苷酶在法布里病的治療、血型轉(zhuǎn)換和異種器官的移植方面有重要應(yīng)用，Alcalay等[18]的研究結(jié)果顯示α-半乳糖苷酶A與帕金森病有關(guān)聯(lián)。在飼料領(lǐng)域，外源添加α-半乳糖苷酶能夠有助于消除豆粕等飼料原料中大豆寡糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高豬和家禽的生產(chǎn)性能，降低飼料成本[19-22]。在食品領(lǐng)域，α-半乳糖苷酶除了可以消除豆?jié){和豆奶中的大豆寡糖，還在制糖工業(yè)中有重要應(yīng)用，能夠消除棉籽糖對(duì)蔗糖的妨礙作用，提高蔗糖得率[23]。此外，在造紙生產(chǎn)中組合使用α-半乳糖苷酶與木聚糖酶可以增強(qiáng)漂白效果[24]，α-半乳糖苷酶能夠與環(huán)糊精相互作用，生成的α-半乳糖-環(huán)糊精在一些重要的保健食品中有應(yīng)用潛力。

米曲霉是糧食食品釀造和釀酒的主要菌種之一，在藥品制備、工業(yè)酶制劑和飼料生產(chǎn)上均有重要而廣泛的應(yīng)用，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局列為公認(rèn)安全的生物體(generally recognized as safe,GRAS)，可以發(fā)酵產(chǎn)生天門冬氨酰氨基肽酶、β-半乳糖苷酶、蛋白酶和角質(zhì)酶等多種酶[25-28]。

本試驗(yàn)組前期從北京市通州區(qū)的土壤中分離得到了1株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的米曲霉，本試驗(yàn)克隆了該米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因galA，依據(jù)畢赤酵母使用密碼子的偏好性進(jìn)行基因序列的優(yōu)化，構(gòu)建畢赤酵母工程菌株，搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)研究其酶學(xué)性質(zhì)，并驗(yàn)證該酶對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)Top 10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，大腸桿菌克隆載體pGM-T、畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母X-33菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存，米曲霉是從北京市通州區(qū)的土壤中分離得到(經(jīng)過18S rRNA序列鑒定)。

1.1.2 工具酶及主要試劑

Phusion DNA聚合酶、EcoRⅠ和NotⅠ購(gòu)自New England Biolabs公司，Zeocin購(gòu)自Invitrogen公司，dNTPs和SacⅠ購(gòu)自TaKaRa公司，對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)購(gòu)自Solarbio公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒和高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，棉籽糖和蔗糖購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，半乳糖和水蘇糖購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉來源α-半乳糖苷酶基因galA的克隆與分析

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的米曲霉來源α-半乳糖苷酶基因galA的mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：XP_001817311.1)為依據(jù)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物galA-F(5′-ATGCGACTTATCACAAGATGGATACCGCTA-3′)和galA-R(5′-TTACAATGCGACATGGACACCAGCGGGTAA-3′)，以米曲霉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增效果。將回收后的基因片段與載體pGM-T于16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒pGM-T-galA送至北京梓熙生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物為galA-F和galA-R。序列結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 α-半乳糖苷酶基因galA畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建

以pGM-T-galA為模板，以EcoRⅠ-galA-F和NotⅠ-galA-R為引物，擴(kuò)增質(zhì)粒中的galA基因。引物序列如下：EcoRⅠ-galA-F，5′-CCGGAATTCATGCGACTTATCACAAG-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，NotⅠ-galA-R，5′-ATTTGCGGCCGCTTACAATGCGACATG-3′(下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn))。PCR的反應(yīng)條件同1.2.1。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物和載體pPICZαA進(jìn)行雙酶切，置于37 ℃水浴酶切12 h后，將基因片段與載體于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞。將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-galA-wt(wt表示野生型，下同)送至北京梓熙生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物為AOX-F和AOX-R，序列結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行分析。

根據(jù)畢赤酵母使用密碼子的偏好性，對(duì)使用頻率低的密碼子進(jìn)行替換，優(yōu)化galA的基因序列。優(yōu)化的合成和測(cè)序由北京梓熙生物科技有限公司完成。優(yōu)化后的表達(dá)載體pPIC-galA-opt(opt表示優(yōu)化型，下同)的構(gòu)建方法同上。

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-galA-wt和pPIC-galA-opt用限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化。37 ℃酶切過夜后電轉(zhuǎn)入新配制的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，電擊完成后立即加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液，充分混勻后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，28 ℃培養(yǎng)3 h。將菌體懸液涂布于YPDS固體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)，28 ℃培養(yǎng)約3 d，直至長(zhǎng)出清晰的菌落。挑取單菌落劃線至YPD固體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，至菌落清晰。

1.2.3 重組菌株的搖瓶發(fā)酵

挑取X33/galA-wt和X33/galA-opt單菌落，分別接種于10 mL的YPD液體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)中，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)約24 h，取100 μL的菌液至50 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)至600 nm波長(zhǎng)下吸光度(OD600)達(dá)到2.0，將全部BMGY液體培養(yǎng)基以5 000 r/min、4 ℃離心10 min,棄掉上清，用50 mL的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)。每24 h向培養(yǎng)液中加無水甲醇(終濃度0.5%)進(jìn)行誘導(dǎo)。120 h后，將菌液于常溫下12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于4 ℃保存。

1.2.4 α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定

參照Rezessy-Szabó等[29]的方法進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定。配制濃度分別為0、2、4、8、16、24、32和40 μmol/L的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，測(cè)定溶液在405 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD405)。以O(shè)D405為橫坐標(biāo)，以對(duì)硝基苯酚的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取100 μL底物溶液pNPG(10 mmol/L)與100 μL用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋的酶液，55 ℃條件下反應(yīng)10 min，加入800 μL的Na2CO3溶液(0.5 mol/L)終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的OD405。α-半乳糖苷酶活性的定義為：在55 ℃和pH 4.33的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的pNPG底物溶液中釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1個(gè)活性單位(U)。

1.2.5 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

最適pH：配制pH分別為2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，用上述不同pH的緩沖液稀釋酶液和配制10 mmol/L的pNPG底物溶液，在55 ℃條件下測(cè)定α-半乳糖苷酶活性。

pH穩(wěn)定性：在室溫下，將酶液分別在上述不同pH的緩沖液中預(yù)處理30 min，最適條件下測(cè)定殘余α-半乳糖苷酶活性。

最適溫度：分別在10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃下測(cè)定α-半乳糖苷酶活性，確定最適溫度。

溫度穩(wěn)定性：將酶液分別置于40和45 ℃保溫100 min，每20 min取樣；分別置于50 和55 ℃保溫50 min，每10 min取樣；置于60 ℃保溫12 min，每2 min取樣；置于65 ℃保溫10 min，每2 min取樣；置于70 ℃保溫5 min，每1 min取樣。每個(gè)溫度設(shè)置1個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組的酶液置于4 ℃保溫，其余條件均與試驗(yàn)組相同。處理后在最適條件下測(cè)定α-半乳糖苷酶活性。

金屬離子抗性：用最適pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制濃度為20 mmol/L的不同金屬化合物[CuSO4、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、CaCl2、ZnSO4、NaCl、CoSO4、NaNO3和MnSO4]溶液，將酶液與金屬化合物溶液等體積混合，使金屬離子終濃度為10 mmol/L。以不添加金屬離子的酶液作為空白對(duì)照。室溫下處理1 h后在最適條件下測(cè)定α-半乳糖苷酶活性。

酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)：用最適pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制濃度分別為1、10/9、5/4、10/7、5/3、2、5/2、10/3、5、10和20 mmol/L的pNPG底物溶液。在最適條件下測(cè)定α-半乳糖苷酶活性。根據(jù)Eadie-Hofstee作圖法測(cè)定米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)。

1.2.6 α-半乳糖苷酶對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的體外酶解效果分析

將自制的10%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))豆?jié){溶液以10 000 r/min離心15 min后取上清液，用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH為5.00，作為反應(yīng)液。取10 mL上述豆?jié){反應(yīng)液于15 mL離心管中，按照以下條件設(shè)置進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，分別是：1)加酶量0.6 U，溫度25 ℃；2)加酶量1.2 U，溫度25 ℃；3)加酶量2.4 U，溫度25 ℃；4)加酶量0.6 U，溫度45 ℃；5)加酶量1.2 U，溫度45 ℃；6)加酶量2.4 U，溫度45 ℃。每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行1個(gè)對(duì)照，對(duì)照加入2 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.33)。在反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0和12.0 h時(shí)分別取樣500 μL，立即100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫后10 000 r/min離心10 min，用超純水將上清液稀釋500倍，過0.10 μm濾膜于接樣瓶中，進(jìn)行離子色譜，分析其半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量的變化，并根據(jù)水蘇糖和棉籽糖含量的變化計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶基因gal A的PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)分析

以提取的米曲霉總DNA為模板，用特異性引物galA-F和galA-R來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1，在約1 600 bp處可見1條清晰的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：α-半乳糖苷酶基因gal A PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物與大腸桿菌克隆載體pGM-T連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到的DNA片段為目的基因，基因全長(zhǎng)1 605 bp，不含內(nèi)含子，編碼534個(gè)氨基酸，包含25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，有2個(gè)天冬氨酸催化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.57(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)，屬于糖基水解酶27(GH27)家族。

將該基因與NCBI上已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖2。本試驗(yàn)中米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因galA與2種已報(bào)道的米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因(NCBI參考序列：XP_001817311.1；GenBank登錄號(hào)：OOO13450.1)的序列一致性為100%，但關(guān)于這2種酶的酶學(xué)性質(zhì)并沒有報(bào)道。

米曲霉 Aspergillus oryzae(GenBank登錄號(hào)：OOO13450.1)；米曲霉RIB40 Aspergillus oryzae RIB40(NCBI參考序列：XP_001817311.1)；黃曲霉NRRL3357 Aspergillus flavus NRRL3357(NCBI參考序列：XP_002372370.1)；黃曲霉AF70 Aspergillus flavus AF70(GenBank登錄號(hào)：KOC13641.1)；寄生曲霉SU-1 Aspergillus parasiticus SU-1(GenBank登錄號(hào)：KJK61669.1)；Aspergillus arachidicola(GenBank登錄號(hào)：PIG89641.1)；Aspergillus bombycis(NCBI參考序列：XP_022394533.1)；黑曲霉ATCC1015 Aspergillus niger ATCC1015(GenBank登錄號(hào)：EHA18663.1)；黑曲霉 Aspergillus niger(GenBank登錄號(hào)：SPB52066.1)；黑曲霉 Aspergillus niger(UniProtKB/Swiss-Prot：P28351.1)。

2.2 α-半乳糖苷酶基因序列的優(yōu)化

根據(jù)畢赤酵母使用密碼子的偏好性，以不改變氨基酸序列為前提，對(duì)去除信號(hào)肽的α-半乳糖苷酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后的序列比較見圖3，galA-wt與galA-opt核苷酸序列的一致性為76.68%。

黑色陰影為野生序列與優(yōu)化序列一致部分。

2.3 畢赤酵母工程菌株的搖瓶表達(dá)

將構(gòu)建好的野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵最初的48 h，野生型和優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性均快速提高，隨后增速減緩。在搖瓶發(fā)酵全過程中，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性始終高于野生型工程菌株。誘導(dǎo)120 h后，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株搖瓶表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖見圖4。將目的條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果顯示搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物確為α-半乳糖苷酶。

表1 重組菌株搖瓶發(fā)酵活力

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：優(yōu)化型工程菌株；4～6：野生型工程菌株。

2.4 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適pH和pH穩(wěn)定性

55 ℃條件下，測(cè)定α-半乳糖苷酶在pH 2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的活性，結(jié)果顯示，α-半乳糖苷酶活性最大值出現(xiàn)在pH 3.00～5.00間。因此，在pH 3.00～5.00間再設(shè)置梯度，55 ℃條件下再次測(cè)定α-半乳糖苷酶在pH 2.00、3.00、3.33、3.66、4.00、4.33、4.66、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的活性，結(jié)果顯示，該酶的最適pH為4.33，當(dāng)pH在3.33～5.00間時(shí)可保持60%以上的相對(duì)活性(圖5)。

室溫下，將酶液在不同pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中預(yù)處理30 min后，在最適條件下測(cè)殘余α-半乳糖苷酶活性，結(jié)果如圖6所示，該酶在pH 3.00～8.00的條件下穩(wěn)定性良好，在pH 2.00條件下處理30 min后，仍保持60%的相對(duì)活性。

圖5 pH對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響

2.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在pH 4.33的條件下，分別于10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃的溫度下測(cè)定α-半乳糖苷酶的活性，結(jié)果顯示，α-半乳糖苷酶的最適溫度為55 ℃。當(dāng)溫度低于55 ℃時(shí)，該酶的活性隨溫度的升高而逐漸增加；當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，該酶的活性則隨溫度的升高而下降。當(dāng)溫度在40～60 ℃間時(shí)，該酶的相對(duì)活性可保持在50%以上(圖7)。

圖8顯示的是α-半乳糖苷酶活性的溫度穩(wěn)定性，該酶在40和45 ℃條件下預(yù)處理100 min，活性幾乎不變；在50 ℃條件下預(yù)處理50 min，活性幾乎不變；在55 ℃條件下預(yù)處理50 min后殘余α-半乳糖苷酶的相對(duì)活性約為50%；當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，短時(shí)間內(nèi)α-半乳糖苷酶即可失活。

圖6 α-半乳糖苷酶活性的pH穩(wěn)定性

圖7 溫度對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響

圖8 α-半乳糖苷酶活性的溫度穩(wěn)定性

2.4.3 金屬離子抗性

從表2可知，MnSO4對(duì)α-半乳糖苷酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，而KCl、(NH4)2SO4和CuSO4則可提高α-半乳糖苷酶的活性。其他金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響不明顯。

表2 金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響

2.4.4 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以pNPG為底物，用Eadie-Hofstee作圖法測(cè)定Km和Vmax，結(jié)果如圖9所示?？芍?，該酶的Km為0.024 3 mol/L，Vmax為1.0×10-7mol/(L·s)。

v：平均反應(yīng)速率[mol/(L·s)]；[S]：底物濃度(mol/L)。

2.5 α-半乳糖苷酶對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

設(shè)置不同的溫度和不同加酶量，驗(yàn)證α-半乳糖苷酶對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果。對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行離子色譜分析，根據(jù)各組分的保留時(shí)間采用外標(biāo)法對(duì)峰面積積分，得出各組分的含量。記錄結(jié)果，分析并計(jì)算各處理?xiàng)l件下棉籽糖和水蘇糖隨酶解時(shí)間的增加其含量的變化。結(jié)果顯示，在25 ℃條件下，3個(gè)加酶量處理下棉籽糖和水蘇糖的含量均幾乎不變，在45 ℃條件下，3個(gè)加酶量處理下中棉籽糖和水蘇糖的含量有所減少，且加酶量大的處理減少的更多，反應(yīng)12 h后，加酶量為1.2 U的處理棉籽糖降解率為4.8%，水蘇糖降解率為8.0%，加酶量為2.4 U的處理棉籽糖降解率達(dá)到50.0%，水蘇糖降解率達(dá)到31.9%。

3 討 論

3.1 α-半乳糖苷酶基因序列的優(yōu)化

畢赤酵母是一種常用的外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其對(duì)密碼子具有偏好性，當(dāng)序列中出現(xiàn)較多的稀有密碼子時(shí)，表達(dá)效率可能表現(xiàn)出明顯的降低，甚至導(dǎo)致翻譯提前終止，蛋白質(zhì)表達(dá)受阻。因此，研究中通常根據(jù)畢赤酵母使用密碼子的偏好性，用常用的密碼子替換稀有密碼子，對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，可以明顯提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Chang等[30]根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)皺落假絲酵母脂肪酶基因序列進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明優(yōu)化后的脂肪酶蛋白質(zhì)表達(dá)量為152 mg/L，是野生型(33 mg/L)的4.6倍。在本試驗(yàn)中，根據(jù)畢赤酵母使用密碼子的偏好性，以不改變氨基酸序列為前提，對(duì)去除信號(hào)肽的α-半乳糖苷酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，galA-wt與galA-opt核苷酸序列的一致性為76.68%。優(yōu)化型和野生型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株同時(shí)發(fā)酵120 h，在發(fā)酵過程中優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性高于野生型工程菌株，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。

3.2 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

來源不同，α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)也各不相同。真菌來源的α-半乳糖苷酶最適pH通常在4～6，最適溫度一般在40～70 ℃。Katrolia等[31]對(duì)米黑根毛霉α-半乳糖苷酶基因進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果顯示，其α-半乳糖苷酶基因開放閱讀框?yàn)? 256 bp，編碼751個(gè)氨基酸，最適pH和最適溫度分別為4.5和60 ℃。Rezessy-Szabó等[29]對(duì)疏棉狀嗜熱絲孢菌CBS 396.62/b中的α-半乳糖苷酶進(jìn)行研究，顯示該酶的最適pH為5.0～5.5，最適溫度為65 ℃。本試驗(yàn)中，米曲霉來源的α-半乳糖苷酶在pH 4.33和溫度55 ℃條件下相對(duì)活性最大。在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)酶的穩(wěn)定性特別是溫度穩(wěn)定性要求較高，對(duì)酶熱穩(wěn)定性的研究也逐漸增多。Aulitto等[6]報(bào)道的產(chǎn)耐熱性α-半乳糖苷酶的菌株嗜熱細(xì)菌HB27的最適溫度為90 ℃，在70 ℃下6 h后殘余α-半乳糖苷酶相對(duì)活性高達(dá)90%，30 h后仍可達(dá)50%，在90 ℃下保持1 h后殘余α-半乳糖苷酶相對(duì)活性約為50%。

本試驗(yàn)中研究的α-半乳糖苷酶具有較好的pH穩(wěn)定性，在pH 3.00～8.00的條件下處理30 min活性幾乎不變，在pH 2.00條件下處理30 min后，仍保持60%的相對(duì)活性。溫度穩(wěn)定性方面，該酶在溫度低于55 ℃時(shí)穩(wěn)定性較高，在55 ℃條件下50 min后殘余α-半乳糖苷酶相對(duì)活性為50%，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，10 min后α-半乳糖苷酶的活性損失接近1/2，70 ℃條件下5 min后α-半乳糖苷酶即完全失活。此外，本試驗(yàn)得到的α-半乳糖苷酶對(duì)試驗(yàn)中的大部分金屬離子的抗性較好，而MnSO4對(duì)α-半乳糖苷酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，KCl、(NH4)2SO4和CuSO4則可提高α-半乳糖苷酶的活性。

3.3 α-半乳糖苷酶對(duì)豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

α-半乳糖苷酶酶解大豆寡糖屬于消除大豆寡糖抗?fàn)I養(yǎng)作用的生物學(xué)方法。Huang等[32]將巨大芽孢桿菌來源的α-半乳糖苷酶在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其最適溫度為37 ℃，最適pH為6.8，向1 mL豆?jié){中加入1 U/mL該酶或者該酶與胰蛋白酶的混合物，37 ℃條件下進(jìn)行酶解，可有效降解豆?jié){中的棉籽糖和水蘇糖，且α-半乳糖苷酶與胰蛋白酶同時(shí)存在時(shí)更利于大豆寡糖的降解，4 h內(nèi)即可完全降解豆?jié){中的棉籽糖和水蘇糖。在本試驗(yàn)中，用發(fā)酵所得的粗酶液超濾掉金屬離子后進(jìn)行豆?jié){中大豆寡糖的酶解，設(shè)置2個(gè)溫度(25和45 ℃)和3個(gè)加酶量(0.6、1.2和2.4 U)，對(duì)10 mL豆?jié){(調(diào)節(jié)pH為5.00)進(jìn)行酶解。較低溫度(25 ℃)條件下豆?jié){中棉籽糖和水蘇糖的含量幾乎不變，較高溫度(45 ℃)與最高加酶量(2.4 U)條件下酶解12 h，棉籽糖和水蘇糖的降解率分別為50.0%和31.9%。與其他大豆寡糖降解試驗(yàn)的結(jié)果相比，本試驗(yàn)中棉籽糖和水蘇糖的降解效率低且降解效果差，造成這一現(xiàn)象的原因可能有：1)豆?jié){的pH為6.30[33]，本試驗(yàn)中α-半乳糖苷酶的最適pH為4.33，pH穩(wěn)定性表明該酶在pH 3.00～8.00的條件下室溫處理30 min后保持大約90%的相對(duì)活性，且pH為5.00時(shí)的穩(wěn)定性好于pH為6.00時(shí)(相對(duì)活性分別為103%和99%)，由于酶解反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為了讓酶在反應(yīng)過程中保持更好的穩(wěn)定性，選擇用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)豆?jié){pH為5.00后再加酶進(jìn)行反應(yīng)。已有的α-半乳糖苷酶酶解豆?jié){的研究中，或者選擇酶的最適pH為反應(yīng)條件[32]，或者直接向豆?jié){中加入酶液[33-34]，棉籽糖和水蘇糖均被完全降解。本試驗(yàn)中選擇的pH條件不合適，可能導(dǎo)致α-半乳糖苷酶的活性被抑制，無法發(fā)揮酶解作用。2)反應(yīng)體系不合適。本試驗(yàn)中加酶量較低，需要降解的豆?jié){體系較多，反應(yīng)過程中酶與底物接觸不充分，導(dǎo)致酶解不充分。3)本試驗(yàn)中25 ℃條件下棉籽糖和水蘇糖幾乎沒有被降解，這可能是低溫下α-半乳糖苷酶活性受到抑制，也可能與大豆中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的抑制作用有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)克隆出了米曲霉來源α-半乳糖苷酶galA基因序列，該基因全長(zhǎng)1 605 bp，不含內(nèi)含子，編碼534個(gè)氨基酸，含有1個(gè)25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽；構(gòu)建了野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株，搖瓶發(fā)酵120 h后α-半乳糖苷酶活性分別為0.507和1.952 U/mL，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。

② 本試驗(yàn)中生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶的最適pH為4.33，最適溫度為55 ℃，有較好的金屬離子抗性，以pNPG為底物進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，該酶的Km為0.024 3 mol/L，Vmax為1.0×10-7mol/(L·s)。

③ 用本試驗(yàn)中生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶進(jìn)行豆?jié){中大豆寡糖的體外酶解試驗(yàn)，當(dāng)溫度為45 ℃、加酶量為2.4 U時(shí)，反應(yīng)12 h后棉籽糖的降解率為50.0%，水蘇糖的降解率為31.9%，降解效果較好，該α-半乳糖苷酶對(duì)降解大豆寡糖具有潛力。