短期限飼對生長肉兔脂肪組織中脂質(zhì)代謝的影響

張 斌 劉 磊* 王 誠 劉漢中 余志菊 李福昌

(1．山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安 271018；2．山東健源生物科技有限公司，泰安 271000；3.四川省草原科學研究院，成都 610091)

限飼影響動物許多的生理代謝過程。在人方面的研究發(fā)現(xiàn)，限飼能延長壽命、減少疾病[1]、改變能量代謝和免疫反應[2]。在幼齡動物方面的研究發(fā)現(xiàn)，限飼可提高肉或胴體質(zhì)量[3]、促進胃腸排空、提高營養(yǎng)物質(zhì)消化[4]以及控制肥胖以防后期肥胖帶來的生殖問題[5]。生長肉兔的腸道壁薄，易損傷，尤其是剛斷奶后的生長肉兔體內(nèi)消化酶分泌不足，極易導致消化功能紊亂[6]，自由采食容易帶來嚴重的腸道問題。通過限飼(飼喂量為自由采食85%左右)1周，可明顯觀察到限飼促進了生長肉兔小腸絨毛和隱窩發(fā)育[7]。Gidenne等[8]通過采用較溫和的限飼試驗發(fā)現(xiàn)，一定程度的限飼可以降低生長肉兔的發(fā)病率和死亡率。并且通過一定量限飼可以改善生長肉兔的腸道生理狀態(tài)，引導食糞行為，降低飼糧在消化道通過的速率，改善其在盲腸的發(fā)酵[9]。在生長肉兔生產(chǎn)中常采用限飼方式，不僅可改善腸道問題，還可以影響脂肪代謝在體內(nèi)的沉積，從而改變?nèi)馄焚|(zhì)，但限飼對生長肉兔脂肪代謝的影響機制仍未確定。

生長肉兔是一種草食性動物，脂肪組織在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要的作用，它不僅是脂肪儲存的主要組織，也在脂肪合成過程中發(fā)揮重要的作用。其中，一些相關的酶在脂肪代謝過程中發(fā)揮控制作用，如激素敏感脂肪酶(HSL)是調(diào)節(jié)脂肪動員的關鍵酶，是脂肪分解的限速酶[10]；脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成過程的關鍵酶，而肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)是長鏈脂肪酸分解的限速酶[11]；脂蛋白脂酶(LPL)是脂質(zhì)代謝中的關鍵酶，可水解極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯[12]。此外，脂肪代謝過程還受到體內(nèi)一些信號通路的影響，如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)、G蛋白偶聯(lián)受體(GPR41/43)、磷酸腺苷激活蛋白酶(AMPK)等。本試驗旨在研究短期限飼對生長肉兔脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關基因表達和相關信號通路的影響，闡明短期限飼對生長肉兔脂肪代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養(yǎng)管理

試驗選取40日齡、體重相近[(1 510±10) g]的伊拉肉兔40只，隨機分為2組：對照組(自由采食組)和限飼組(飼喂量是對照組的70%左右)，每組20個重復，每個重復1只兔，試驗持續(xù)5 d。限飼量和持續(xù)時間參考文獻[7-8]設置。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗兔單籠飼養(yǎng)，自然采光、通風，自由飲水。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet:復合維生素 decavitamin 100 mg，膽堿 choline chloride 250 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 50 mg，Mn (as manganese sulfate) 4 mg，Cu (as copper sulfate) 27 mg，CaHPO4750 mg，NaCl 2 500 mg，賴氨酸 Lys 500 mg，蛋氨酸 Met 1 000 mg，石粉 limestone 750 mg,其余為麥飯石載體補足 supplying by maifan stone carrier。

1.2 生長性能的測定及樣品采集

試驗期間每天記錄生長肉兔的采食量和體重。試驗結(jié)束后，采用頸脫位法將生長肉兔處死，分離并稱重肩周脂肪和腎周脂肪，收集樣品，放置于液氮快速冷凍，并將樣品儲存于-80 ℃。

1.3 基因表達的測定

脂肪組織中總RNA用異硫氰二胍鹽法提取，利用瓊脂糖凝膠電泳和生物分光光度計分別檢測RNA的質(zhì)量和濃度，具體步驟參考文獻[13-14]的描述。按照TaKaRa RNA PCR反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，表2為相關基因的引物序列。采用2-ΔΔCt法定量目標基因的表達量，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為參照基因進行校正。

1.4 脂肪組織甘油三酯濃度和蛋白表達的測定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒，通過酶標儀(SpectraMax iD3，美國)測定脂肪組織中甘油三酯濃度。

用蛋白裂解液裂解脂肪組織后，取上清液用BCA蛋白濃度試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，北京)測定上清液中總蛋白含量，然后在100 ℃下煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，加入到制備好的聚丙酰胺凝膠中，上樣量為20 μL，20 mA電泳分離蛋白，至分離出目的蛋白條帶，隨后在4 ℃、100 V下將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下封閉液封閉1 h，然后經(jīng)一抗二抗孵育后用ECL顯色液進行熒光顯色，置于蛋白凝膠成像儀器(Vilber，法國)下成像，利用Fusion軟件進行目的蛋白定量分析，得到脂肪組織目的蛋白表達量。

表2 相關基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析，如果處理效應差異顯著(P<0.05)，采用Duncan氏法進行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 短期限飼對生長肉兔生長性能的影響

如表3所示，短期限飼顯著降低了生長肉兔的日增重(P<0.05)，有降低生長肉兔體內(nèi)總脂肪沉積量的趨勢，對生長肉兔體內(nèi)肩胛脂肪和腎周脂肪的沉積量影響不顯著(P>0.05)。

表3 短期限飼對生長肉兔生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2 短期限飼對生長肉兔脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關基因及蛋白表達的影響

如圖1所示，與對照組相比,短期限飼顯著降低了FAS、ACC、LPL的基因表達(P<0.05)，卻顯著升高了PPARα、PPARγ、CPT1、CPT2和GPR41的基因表達(P<0.05)，對HSL和GPR43的基因表達無顯著影響(P>0.05)。

HSL:激素敏感脂肪酶 hormone sensitive lipase；FAS：脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase；ACC:乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase；LPL:脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase；PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α peroxisome proliferator-activated receptor α;PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferator-activated receptor γ；CPT1:肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1 carnitine acyl transferase 1;CPT2:肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶2 carnitine acyl transferase 2; GPR41:G蛋白偶聯(lián)受體41 G-protein-coupled receptors 41;GPR43:G蛋白偶聯(lián)受體43 G-protein-coupled receptors 43。

如圖2所示，短期限飼對脂肪中甘油三酯的濃度和磷酸化的AMPK蛋白表達的影響均不顯著(P>0.05)。

圖2 短期限飼對生長肉兔脂肪組織中甘油三酯濃度(A)和磷酸化的磷酸腺苷激活蛋白酶蛋白表達(B)的影響

3 討 論

動物體脂沉積是一個復雜的生理生化過程，品種、生長階段及營養(yǎng)水平都可影響動物機體脂肪的沉積。動物體脂沉積的多少取決于脂肪酸的合成、分解、轉(zhuǎn)運以及脂肪細胞的分化和脂質(zhì)的分解等過程。HSL是脂肪分解的關鍵酶，主要表達在脂肪組織中，將甘油三酯分解成甘油和脂肪酸以滿足動物體的需要[10]，本試驗中短期限飼并未顯著改變脂肪中HSL的基因表達和甘油三酯的濃度，說明短期限飼并未顯著改變脂肪組織中脂質(zhì)分解這一過程。LPL主要由脂肪組織合成并分泌到血液中，將血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解為脂肪酸[12]，LPL與機體的脂類代謝及肥胖密切相關，白色脂肪組織中LPL的活性升高有助于機體脂類的貯存[15]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，短期限飼顯著降低了脂肪組織中LPL的基因表達，這與骨骼肌中的研究結(jié)果不同，張慧等[16]發(fā)現(xiàn)，限飼顯著提高了家禽骨骼肌中LPL的基因表達。這些結(jié)果說明，短期限飼中血液的乳糜微粒和極低密度脂蛋白水解產(chǎn)生的甘油三酯主要流向骨骼肌去供能，而非脂肪組織。CPT位于線粒體外膜，負責將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運進入線粒體[17]。本試驗中，短期限飼顯著提高了脂肪組織中CPT1和CPT2的基因表達，與前人研究結(jié)果[18]相似，說明進入線粒體進行β-氧化的脂肪酸增多，脂肪酸的氧化作用增強，較多的脂肪酸為機體提供能量。FAS催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸；ACC催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A反應的生物素酶，是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶。本研究發(fā)現(xiàn)，短期限飼顯著降低了脂肪組織中FAS和ACC的基因表達，表明脂肪酸的從頭合成過程降低?？傊?，短期限飼抑制了脂肪組織中脂肪酸合成過程，促進長鏈脂肪酸酸的β-氧化過程；同時血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白水解產(chǎn)生的甘油三酯流向脂肪組織過程降低。

PPARs是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子，PPARα和PPARγ屬于PPARs超家族成員，通過線粒體及過氧化物酶體的β-氧化作用調(diào)控游離脂肪酸的氧化、吸收，參與調(diào)控脂肪代謝[19]。PPARγ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是刺激脂肪細胞分化的關鍵因子[20]，本試驗中發(fā)現(xiàn)，短期限飼增加了脂肪組織中PPARγ的轉(zhuǎn)錄，表明脂肪細胞分化過程加強。PPARα能與配體結(jié)合而活化，從而增強與脂質(zhì)代謝有關的酶和基因轉(zhuǎn)錄，如CPT、?；o酶A合成酶、酰基輔酶A氧化酶等，使組織氧化脂肪酸能力加強[21]。本試驗中，短期限飼處理后PPARα、CPT1和CPT2基因表達一致，表明限飼過程中PPARα可能參與了脂肪酸氧化過程。

GPR41和GPR43是目前已發(fā)現(xiàn)的僅有的2種特異性短鏈脂肪酸受體，在調(diào)控脂類代謝和免疫反應等生物學過程以及在動物腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收中發(fā)揮重要作用。激活GPR41和GPR43后促進了脂肪組織分泌瘦素[22]。GPR41激活后還可引起交感神經(jīng)的興奮，提高心率，并在采食后增加能量的消耗[23]。前期試驗發(fā)現(xiàn)，在家兔的脂肪組織中有大量的GPR41和GPR43的基因表達[24]，并且限飼顯著增加了GPR41的基因表達，但未顯著改變GPR43的基因表達，表明GPR41在家兔的能量代謝中發(fā)揮重要的作用，激活GPR41后能通過上調(diào)PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化。因此，短期限飼后PPARγ基因表達的增加可能是因為GPR41基因表達上調(diào)引起的[25]。

AMPK是細胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其主要功能是根據(jù)機體的需能狀況來調(diào)節(jié)產(chǎn)能和耗能。在脂質(zhì)代謝過程中，AMPK作為能量調(diào)節(jié)器，調(diào)控細胞并對多種胞內(nèi)刺激信號做出應答。在牛乳腺上皮細胞中激活AMPK可抑制脂肪酸合成[26]。在3T3-L1細胞中激活AMPK下調(diào)了PPARγ的表達[27]?；罨腁MPK可以抑制膽固醇、甘油二酯、甘油三酯以及脂肪酸的合成，使ACC的活性顯著下降或喪失，提高脂肪酸的氧化速度[28]。以上研究均表明，AMPK在脂質(zhì)代謝及脂肪細胞成脂分化中扮演重要的角色。但在本試驗中未發(fā)現(xiàn)生長肉兔脂肪中AMPK的蛋白磷酸化水平有顯著變化，這一結(jié)果與肝臟中的發(fā)現(xiàn)相一致[18]，但與骨骼肌中的結(jié)果不一致，限飼顯著增加了骨骼肌中AMPK的蛋白磷酸化水平[29]。這些結(jié)果說明，不同部位的AMPK對飼糧中能量狀態(tài)的改變程度不一樣。

4 結(jié) 論

短期限飼顯著增加了生長肉兔脂肪組織中CPT1、CPT2、PPARγ的基因表達，卻顯著降低了FAS、ACC、LPL的基因表達，表明生長肉兔脂肪組織中脂肪酸合成過程受到抑制，分解過程增加，細胞分化過程增加；此外，PPARα和GPR41信號通路可能參與了生長肉兔脂肪組織能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。