飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能及肝胰腺代謝酶活性、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和Toll樣受體通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

江婷琪 余王舒 趙小曼 任次成 謝鵬鵬 孔有琴 張易祥 葉金云 丁志麗

(浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000)

糖和脂肪是水產(chǎn)動(dòng)物重要的非蛋白質(zhì)能量來(lái)源，相比蛋白質(zhì)，其不僅價(jià)格低廉，而且能提高蛋白質(zhì)的利用效率[1-3]。因此，近年來(lái)關(guān)于糖和脂肪的營(yíng)養(yǎng)與生理研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。脂肪是能量、必需脂肪酸、磷脂和甾醇的重要來(lái)源，能維持細(xì)胞膜正常生理活動(dòng)、生物學(xué)構(gòu)造和生理功能[4-5]。動(dòng)物體內(nèi)適宜的脂肪和必需脂肪酸含量能提高機(jī)體的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和免疫應(yīng)答效應(yīng)[6-7]。值得注意的是，水產(chǎn)動(dòng)物飼料中脂肪含量過高可能會(huì)引發(fā)一系列問題，如抑制機(jī)體生長(zhǎng)、造成過多的脂肪沉積以及影響代謝水平等[8-12]。相比脂肪，糖是水產(chǎn)動(dòng)物更廉價(jià)且更易獲得的能量來(lái)源。然而，機(jī)體內(nèi)糖含量不足或過多可能會(huì)抑制機(jī)體生長(zhǎng)、影響代謝、減弱機(jī)體的免疫應(yīng)答效應(yīng)[13-17]。因此，飼料中最適宜的糖脂比對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、維持正常生理功能和健康狀況十分重要。一旦飼料中脂肪和糖含量以及比例失衡，就很可能會(huì)影響到機(jī)體的代謝途徑[18]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者致力于研究既能促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能取得最大經(jīng)濟(jì)效益的飼料適宜糖脂比。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料糖脂比適宜時(shí)，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)幼魚的生長(zhǎng)性能最佳[19]，大黃魚(Larmichthyscrocea)的生長(zhǎng)性能和飼料利用率得到提高[20]，類似的研究結(jié)果在對(duì)羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]的研究中也得到證實(shí)。然而，當(dāng)糖脂比持續(xù)升高時(shí)，鯉魚(Cyprinuscarpio)的組織消化酶活性受到抑制[21]，抗氧化能力下降，生長(zhǎng)性能受到影響[22]。當(dāng)飼料糖脂比降低時(shí)，建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)幼魚全魚、胴體和肝臟中脂肪含量以及臟體比均顯著升高，且較高的脂肪含量抑制了建鯉對(duì)蛋白質(zhì)和糖的利用[23]。

在哺乳動(dòng)物中，肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的主要器官，肝細(xì)胞中一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)參與了脂質(zhì)代謝的過程。甘油三酯進(jìn)入淋巴循環(huán)，在脂肪甘油三酯脂肪酶、激素敏感性脂肪酶(HSL)和單脂脂肪酶的作用下，水解為甘油和脂肪酸，失去絕大部分甘油三酯的殘留乳糜微粒與肝臟中的受體如低密度脂蛋白(LDL)受體、LDL受體相關(guān)蛋白或B類Ⅰ型清道夫受體(SR-BⅠ)結(jié)合，通過胞吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞[24]。隨后，在肝臟中，完整的跨膜蛋白如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)家族(FATP-1～6)促進(jìn)了長(zhǎng)鏈和極長(zhǎng)鏈脂肪酸從血漿池轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)[25-26]。在胞膜上，脂肪酸與脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)結(jié)合并通過細(xì)胞溶膠進(jìn)行降解或儲(chǔ)存[27]。因此，SR-BⅠ、FATP4和FABP10與胞膜或胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。此外，對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(TLRs)通路在其先天免疫中發(fā)揮重要的作用[28]，飼料營(yíng)養(yǎng)與該通路的基因表達(dá)密切相關(guān)[29-32]。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又名青蝦，是東南亞以及我國(guó)的主要淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類之一[33]。目前未見有關(guān)日本沼蝦飼料糖脂比研究的相關(guān)報(bào)道?；谔侵葘?duì)水產(chǎn)動(dòng)物有重要的生理作用，本試驗(yàn)以日本沼蝦為研究對(duì)象，探討飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化性能以及肝胰腺代謝酶活性、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，確定日本沼蝦飼料適宜的糖脂比，旨在為日本沼蝦高效環(huán)保配合飼料的研發(fā)提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料配制

本試驗(yàn)以酪蛋白和魚粉為蛋白質(zhì)源，預(yù)糊化玉米淀粉為糖源，魚油和豆油為脂肪源，配制糖脂比分別為1.12(CL1)、2.00(CL2)、3.56(CL3)、7.10(CL4)和24.12(CL5)的5種等氮(粗蛋白質(zhì)含量為39%)試驗(yàn)飼料，糖脂比的設(shè)定過程為：總能恒定、脂肪源添加量為0時(shí)，獲得預(yù)糊化玉米淀粉最大可添加量；預(yù)糊化玉米淀粉添加量最低時(shí)，獲得脂肪源最大可添加量；將脂肪源和預(yù)糊化玉米淀粉的添加量按比例遞減或遞增。飼料配制時(shí)，首先將各種原料粉碎過60目篩，按配方準(zhǔn)確稱量，采用逐級(jí)擴(kuò)大法將維生素和礦物質(zhì)預(yù)混料等微量成分按比例充分混勻，然后加入魚油與豆油的混合油、卵磷脂繼續(xù)搓勻，最后加入水?dāng)嚢杌靹?，用小型飼料造粒機(jī)制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，40 ℃烘干至飼料中水分含量達(dá)到約10%后，密封后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料中粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(Kjeltec 2200凱式定氮儀，F(xiàn)OSS，丹麥)，粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法(SoxtecTM2043脂肪儀，F(xiàn)OSS，丹麥)，粗灰分含量的測(cè)定采用馬福爐550 ℃灼燒(14 h)法，水分含量的測(cè)定采用105 ℃烘干(24 h)恒重法，總能使用氧彈儀(WELL 9000，上海)測(cè)定，粗纖維含量的測(cè)定采用纖維素測(cè)定儀(ANKOM A200i，美國(guó))，無(wú)氮浸出物含量通過公式[無(wú)氮浸出物=100-(水分+粗灰分+粗蛋白質(zhì)+粗脂肪+粗纖維)]計(jì)算獲得，糖脂比的計(jì)算參照文獻(xiàn)[18-20]的方法計(jì)算，即無(wú)氮浸出物含量與粗脂肪含量的比值。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)誘食劑為每千克飼料提供Attractant provided the following per kg of diets：甘氨酸 glycine 60 mg，丙氨酸 alanine 60 mg，谷氨酸 glutamic acid 60 mg，甜菜堿 betain 120 mg。2)每千克維生素預(yù)混料含有Contained the following per kg of vitamin premix：VA 4 200 000 IU，VC 60 g，VE 20 g，VD31 200 000 IU，VK 10 g，VB110 g，VB210 g，VB616 g，VB1220 mg，煙酸 nicotinic acid 50 g，葉酸 folic acid 4 g，肌醇 inositol 60 g，生物素 biotin 100 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 35 g。3)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有Contained the following per kg of mineral premix：KCl 28 g，MgSO4·7H2O 100 g，NaH2PO4215 g，KH2PO4100 g，Ca(H2PO4)2·H2O 265 g，CaCO3105 g，C6H10CaO6·5H2O 165 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 12 g，ZnSO4·7H2O 4.76 g，MnSO4·H2O 1.07 g，AlCl3·6H2O 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.24 g，CoCl2·6H2O 1.4 g，KI 0.23 g，α-纖維素 α-cellulose 2.15 g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用日本沼蝦購(gòu)于湖州邦達(dá)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，暫養(yǎng)1周后，選擇健康、體重均勻[平均體重為(0.104±0.003) g]的蝦體用于試驗(yàn)。將試驗(yàn)蝦隨機(jī)分為5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只，以重復(fù)為單位隨機(jī)放入到體積為300 L的水族箱中，每個(gè)水族箱內(nèi)放置一定量的網(wǎng)片作為躲避物，以減少日本沼蝦互殘。試驗(yàn)于2017年7—9月進(jìn)行，每天早晨吸污并換水(換水量約為1/3)，試驗(yàn)使用的水源為曝氣的自來(lái)水，水質(zhì)條件為：溫度25～29 ℃，pH 7.6～8.1，溶氧濃度>6.5 mg/L，總氨氮濃度<0.01 mg/L。每日上午、下午各投喂1次，投喂量為蝦體重的4%～5%，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，饑餓24 h后，稱重、統(tǒng)計(jì)各組蝦的存活數(shù)。使用解剖器從頭胸部取出每組存活蝦的肝胰腺，保存于-80 ℃用于后續(xù)代謝酶活性、抗氧化指標(biāo)測(cè)定及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫相關(guān)基因表達(dá)分析。

1.4 生長(zhǎng)性能

生長(zhǎng)性能相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

存活率(SR,%)=100×試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活蝦個(gè)體數(shù)/試驗(yàn)開始時(shí)蝦的個(gè)體數(shù)；增重率(WGR,%)=100×(試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的平均體重-試驗(yàn)開始時(shí)蝦的平均體重)/試驗(yàn)開始時(shí)蝦的平均體重； 特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=100×(ln試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的平均體重-ln試驗(yàn)開始時(shí)蝦的平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)。

1.5 肝胰腺代謝酶活性和抗氧化指標(biāo)測(cè)定

用電子天平稱取肝胰腺約0.500 g，按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水制成10%的勻漿液，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液。根據(jù)各種不同指標(biāo)的測(cè)定要求將上清液稀釋成不同濃度，上清液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。肝胰腺糖原、丙二醛(MDA)含量與己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)的測(cè)定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))說明書進(jìn)行。

1.6 脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)分析

使用RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn))提取肝胰腺RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，電泳檢測(cè)RNA的完整性、核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA保存在-20 ℃用于熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。

采用在線Primer 3設(shè)計(jì)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因SR-BⅠ、FABP10、FATP4和TLRs通路相關(guān)基因髓樣分化蛋白88(MyD88)、Toll樣受體3(TLR3)、絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)和絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)qRT-PCR所用引物，具體見表2。

表2 qRT-PCR所用引物序列

F:上游引物forward primer;R:下游引物reverse primer。qRT-PCR反應(yīng)體積為20 μL，包括10 μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq (TaKaRa，日本)，10 μmol/L的上、下游引物各0.2 μL，2 μL模板，7.6 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)后溫度以每5 s 5 ℃的速度從60 ℃上升到95 ℃，繪制熔解曲線，以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性。以日本沼蝦β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(上游引物：5′-GTGCCCATCTACGAGGGTTA-3′，下游引物：5′-CGTCAGGGAGCTCGTAAGAC-3′)為內(nèi)參基因，對(duì)得到的各樣品Ct值進(jìn)行均一化處理，以CL5組基因mRNA為基準(zhǔn)，使用2-ΔΔCt法[34]對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異達(dá)到顯著水平，則進(jìn)行Tukey’s法多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，當(dāng)糖脂比從1.12(CL1組)增加到7.10(CL4組)時(shí)，日本沼蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率變化不顯著(P>0.05)，當(dāng)糖脂比繼續(xù)增加到24.12(CL5組)時(shí)，日本沼蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)。各組日本沼蝦的存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中糖原含量及糖代謝酶活性的影響

由表4可知，CL5組肝胰腺糖原含量顯著高于CL4組(P<0.05)，但CL1、CL2、CL3和CL4組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。CL4組肝胰腺HK和PK活性最高，其HK活性顯著高于CL1組(P<0.05)，PK活性顯著高于其余各組(P<0.05)。

表4 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中糖原含量及糖代謝酶活性的影響

2.3 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，日本沼蝦攝食不同糖脂比的飼料后，肝胰腺中MDA含量、T-AOC、CAT活性未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。CL1和CL2組肝胰腺中SOD活性顯著高于CL4和CL5組(P<0.05)。

表5 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1顯示了飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響。肝胰腺中SR-BⅠ基因的表達(dá)水平在CL1組最高，顯著高于其余各組(P<0.05)，其余各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；同樣，肝胰腺中FATP4基因的表達(dá)水平也在CL1組最高，顯著高于其余各組(P<0.05)；CL4組肝胰腺中FABP10基因的表達(dá)水平顯著高于CL1、CL2和CL3組(P<0.05)，有較低糖脂比的CL1、CL2和CL3組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，有較高糖脂比的CL4、CL5組之間也無(wú)顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示無(wú)顯著差異(P>0.05)。下圖同。

2.5 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖2顯示了飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響。肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因(TLR3、MyD88、IRAK4、TRAF6、MAP3K7和MAPK14)的表達(dá)都受到飼料糖脂比的調(diào)節(jié)。其中，CL3組肝胰腺中TLR3、MyD88、IRAK4、TRAF6、MAP3K7和MAPK14基因的表達(dá)水平均顯著高于其余各組(P<0.05)。

圖2 飼料糖脂比對(duì)日本沼蝦肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料糖脂比在1.12～7.10時(shí)，日本沼蝦生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異，但糖脂比過高達(dá)到24.12時(shí)，日本沼蝦的生長(zhǎng)性能受到抑制，說明日本沼蝦對(duì)糖的利用能力有限，這與之前的研究結(jié)果一致，即飼料中過高的糖含量不利于日本沼蝦的生長(zhǎng)[14]。同時(shí)，這也與在對(duì)紅螯螯蝦[35]以及魚類[18,20,36]上的研究結(jié)果類似，即過高的糖脂比不利于水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。有趣的是，飼料中較高的脂肪含量與較低的糖含量(糖脂比為1.12)并沒有降低或提高日本沼蝦的生長(zhǎng)性能，但是否引起代謝紊亂還有待于進(jìn)一步研究。由于甲殼動(dòng)物對(duì)脂肪的需求受到各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，因此不能精確得出甲殼動(dòng)物對(duì)脂肪的需求量[37]。研究表明，飼料中脂肪含量在4.20%～13.76%時(shí)可滿足三疣梭子蟹的正常生長(zhǎng)[38]，高脂飼料未對(duì)羅非魚的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生顯著影響[39]。這也說明無(wú)論是甲殼動(dòng)物還是魚類，對(duì)飼料中脂肪含量較高時(shí)可能存在一定的調(diào)節(jié)機(jī)制。

PK和HK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶[40]，本研究發(fā)現(xiàn)糖脂比對(duì)肝胰腺中糖代謝酶活性有顯著影響，當(dāng)飼料糖脂比由1.12升高到7.10時(shí)，日本沼蝦肝胰腺中HK和PK活性顯著增加，說明日本沼蝦能將一定水平的飼料糖進(jìn)行氧化作為能量利用。這與在建鯉[23]上的研究結(jié)果相似，即當(dāng)飼料糖脂比由2.3升高到7.7時(shí)，建鯉幼魚肝臟PK和HK活性均顯著升高。同樣，當(dāng)糖脂比從1.33升高到10.75時(shí)，紅螯螯蝦肝胰腺HK和PK活性均顯著增加[35]。然而，當(dāng)糖脂比進(jìn)一步增加時(shí)，日本沼蝦肝胰腺中PK活性顯著降低，這可能是由于高含量的糖(35%)不能激發(fā)PK活性，也間接說明日本沼蝦對(duì)糖的利用能力有限。而從肝胰腺中糖原含量的變化來(lái)看，高含量的糖顯著增加了日本沼蝦肝胰腺中糖原含量，說明日本沼蝦將不能利用的糖作為肝糖原儲(chǔ)存起來(lái)[41-42]。

肝胰腺是甲殼動(dòng)物自由基的主要代謝中心[43]。由于細(xì)胞膜包含磷脂雙分子層，很容易受到自由基的攻擊而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[44]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，常被用來(lái)衡量機(jī)體內(nèi)源性氧化應(yīng)激的狀態(tài)[45]。為了減少氧化應(yīng)激，維持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，生物體進(jìn)化出了多種抗氧化防御反應(yīng)，比如專門的抗氧化酶如SOD和CAT等[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料糖脂比未對(duì)日本沼蝦肝胰腺中MDA含量產(chǎn)生顯著影響，說明不同糖脂比的飼料未對(duì)機(jī)體產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激。但較多的研究表明，高脂或高糖飼料會(huì)引起機(jī)體的氧化應(yīng)激[13,43,47]，這可能是由于不同物種對(duì)糖或脂肪的耐受性能不一致造成的。但從肝胰腺中抗氧化酶SOD的活性來(lái)看，隨著糖脂比的增加，肝胰腺中SOD活性呈下降趨勢(shì)，說明隨著飼料脂肪含量的下降，機(jī)體產(chǎn)生的活性氧(ROS)水平也開始下降。

為了進(jìn)一步了解飼料糖脂比是否影響了蝦體的脂質(zhì)代謝和免疫性能，我們進(jìn)一步測(cè)定了肝胰腺脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和TLRs通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。CD36清道夫受體超家族在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)和先天免疫中起著非常重要的作用[48]，SR-BⅠ作為該家族的一員，參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)，且在細(xì)胞膜脂表達(dá)和細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用[49-50]。日本沼蝦的SR-BⅠ包含CD36結(jié)構(gòu)域，可能具有類似CD36脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其表達(dá)受到飼料脂肪源的調(diào)節(jié)[51]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料較低的糖脂比不僅促進(jìn)了日本沼蝦肝胰腺中SR-BⅠ基因的表達(dá)，還促進(jìn)了長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP4基因的表達(dá)。這與在羅非魚[18]上得出的結(jié)果有一定差異，對(duì)羅非魚的研究顯示飼料糖脂比對(duì)羅非魚肝胰臟中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP5基因的表達(dá)無(wú)顯著影響。出現(xiàn)這樣的差異可能與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類型有關(guān)，也可能與物種有關(guān)。然而，日本沼蝦胞內(nèi)肝臟型脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FABP10[52]基因的表達(dá)水平在糖脂比增加時(shí)(即低脂時(shí))卻顯著增加，該結(jié)果提示胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)可能與胞膜脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)一定相關(guān)性。對(duì)羅非魚的研究同樣表明，相比高脂和中脂組，低脂組羅非魚肝臟中FABP4基因的表達(dá)水平最低，說明低脂組增加了胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)[39]。然而，有關(guān)飼料糖脂比對(duì)上述脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未清晰，仍然需要進(jìn)一步的深入研究。

相比脊椎動(dòng)物發(fā)達(dá)的免疫系統(tǒng)，無(wú)脊椎動(dòng)物主要依賴于先天性的免疫系統(tǒng)防御病原菌。TLRs通路在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用[28]。TLRs可以通過MyD88依賴性和MyD88非依賴性通路激活炎癥因子的表達(dá)[53-55]。研究表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如脂肪酸可以調(diào)控TLRs和MyD88基因的表達(dá)[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)飼料糖脂比為3.56(CL3組)時(shí)，顯著上調(diào)了TLR3和MyD88基因的表達(dá)。TRAF6可以作為分子橋，連接著上游的TLR、MyD88、IRAK基因和下游的核因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路[56]。本試驗(yàn)中，這些上游或下游分子如IRAK4、TRAF6、MAP3K7和MAPK14基因同樣受到飼料糖脂比的調(diào)節(jié)，且變化趨勢(shì)與TLR3和MyD88基因的變化基本一致。盡管有關(guān)糖脂比對(duì)TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的可參考資料較少，但研究表明，飼料中適宜的糖脂比可以提高機(jī)體的免疫力[1,19]。因此，TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)可能與日本沼蝦非特異性免疫反應(yīng)提高有關(guān)。研究表明，TLRs通路相關(guān)基因除了與機(jī)體免疫相關(guān)，還參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程，可緩解病原菌或氧化應(yīng)激帶來(lái)的組織損傷[57-58]。本研究中，飼料糖脂比提高降低了日本沼蝦肝胰腺中SOD活性，說明蝦體產(chǎn)生的ROS減少，盡管CL4和CL5組肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低，但CL1、CL2和CL3組肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因的表達(dá)與SOD活性變化趨勢(shì)不一致，說明TLRs通路相關(guān)基因表達(dá)的變化可能不是完全由氧化應(yīng)激引起的。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)可激活TLRs通路[59]，但多次LPS刺激后，機(jī)體細(xì)胞會(huì)對(duì)LPS的刺激產(chǎn)生耐受和交叉耐受性，即細(xì)胞對(duì)再次刺激的LPS表現(xiàn)為低反應(yīng)性，且對(duì)TLRs配體表現(xiàn)為廣泛的低反應(yīng)性[60]。本研究中，日本沼蝦在攝食高脂飼料(CL1和CL2組)或高糖飼料(CL4和CL5組)長(zhǎng)達(dá)8周后，肝胰腺TLRs通路相關(guān)基因的低表達(dá)不排除存在相似的耐受機(jī)制，但需要在今后研究時(shí)在中間時(shí)段取樣進(jìn)一步驗(yàn)證。也有研究表明，TLRs通路相關(guān)基因的表達(dá)特性與所分析的組織密切相關(guān)，Toll樣受體22(TLR22)和MyD88基因在草魚(Ctenopharyngodonidellus)的肝臟和腎臟中表達(dá)變化趨勢(shì)相反[7]，而本研究?jī)H僅分析了肝胰腺中TLRs通路相關(guān)基因的表達(dá)，其他組織是否有類似的或相反的調(diào)節(jié)方式，有待于進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

① 日本沼蝦對(duì)飼料糖脂比有較大的適應(yīng)性，糖脂比在1.12～7.10時(shí)日本沼蝦增重率無(wú)顯著變化，但過高的糖脂比(24.12)會(huì)抑制其生長(zhǎng)，降低肝胰腺糖酵解關(guān)鍵酶活性，增加肝糖原的累積。

② 飼料糖脂比可調(diào)節(jié)肝胰腺脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(SR-BⅠ、FATP4和FABP10)和TLRs通路相關(guān)基因(TLR3、MyD88、IRAK4、TRAF6、MAP3K7和MAPK14)的表達(dá)。