青貯微生物的發(fā)掘及其應用的研究進展

牛化欣 常 杰 胡宗福 王思珍

(內蒙古民族大學動物科學技術學院，通遼 028000)

據(jù)統(tǒng)計，我國每年玉米籽粒消費量的60%以上用于飼料，但生產玉米的秸稈卻未被高效利用，造成種植業(yè)副產品的飼料轉化利用難度高、效率低。從提高資源的綜合利用率、減少污染、提高產品的附加值等各方面考慮，秸稈的綜合利用十分必要[1]。隨著我國農業(yè)結構戰(zhàn)略性調整和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，大力推進全株青貯玉米種植、發(fā)展反芻動物養(yǎng)殖相結合的“種植-養(yǎng)殖-種植”模式、積極實施“糧改飼”降本增效項目是解決飼料資源短缺問題和人畜爭糧矛盾的重要舉措。為提高和改善反芻動物的生產性能，更好地使全株玉米、苜蓿牧草等轉化為優(yōu)質的飼料，利用青貯微生物發(fā)酵技術，添加有益微生物來改善青貯飼料的品質是非常重要的措施之一[2]。本文從近年來國內外青貯微生物研發(fā)和利用的現(xiàn)狀出發(fā)，結合最新研究進展，將青貯微生物技術、種類及微生物接種劑對青貯飼料的作用機理、營養(yǎng)品質、有氧穩(wěn)定性、動物生產性能的影響進行概述，為進一步改善青貯飼料品質和提高反芻動物生產性能提供理論基礎和應用參考。

1 青貯微生物新菌種的認識與鑒定

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結合現(xiàn)代分子生物技術，如PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術、16S rRNA高通量第2代454焦磷酸測序技術、第3代單分子測序技術、宏基因組(metagenomics)、轉錄組(metatranscriptomic)等，能快速準確檢測微生物多樣性和結構組成[2-6]。Han等[7]利用PCR-DGGE檢測全混合日糧青貯飼料中微生物菌群，同時發(fā)現(xiàn)了耐酸乳桿菌 (Lactobacillusacetotolerans)和腦橋乳桿菌(L.pontis)菌株。Li等[8]利用高通量測序技術在青貯過程中檢測到30多個菌屬群落結構的變化情況。劉晶晶[9]應用Miseq高通量測序技術檢測柳枝稷青貯60 d后的微生物多樣性。陶蓮等[10]通過實驗室檢測手段和Miseq高通量測序技術相結合，能夠在分析青貯品質的同時，提供青貯前后整個菌落構成及豐度變化的信息，進而為發(fā)酵過程的調控提供依據(jù)。Bao等[11]利用第3代單分子測序技術，檢測苜蓿青貯前后微生物的變化及菌落對苜蓿品質的影響，可用于評估青貯飼料微生物變化和質量。本課題組采用Miseq高通量測序技術分析了全株玉米青貯發(fā)酵和暴露空氣過程中的微生物變化規(guī)律及菌落結構的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)短期暴露空氣可增加有害菌——梭菌的繁殖[12]。隨著傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和不斷發(fā)展的PCR新技術的結合，青貯飼料中新的菌種正在不斷被認識和利用，這些新的菌種被分離、篩選，擴大培養(yǎng)后接種到青貯飼料中，再采用PCR-DGGE、高通量測序、宏基因組等方法闡明菌種對青貯發(fā)酵的作用，這是發(fā)掘和利用青貯微生物新菌種行之有效的方法和措施。

近年來，青貯飼料中分離的微生物菌種如表1所示，通過了解這些微生物新種類的生物生長和發(fā)酵特性，可以篩選出對青貯飼料品質有益的種類，作為青貯微生物接種劑，同時，可以查找出對青貯有害的微生物，作為研究青貯抑制菌的參考。

表1 青貯飼料中分離的微生物菌種

續(xù)表1微生物種類Microbial species青貯類型Silage type引用文獻References畢赤酵母菌 Pichia deserticola青貯玉米Li等[24]奧默畢赤酵母 Pichia kudriavzevii青貯玉米Li等[24]發(fā)酵畢赤酵母 Pichia fermentans青貯玉米Rossi等[19]庫德里阿茲威畢赤酵母 Pichia kudriavzevii青貯玉米Li等[24]假絲酵母 Candida apicola玉米、黑麥草Rossi等[19]中間假絲酵母 Candida intermedia青貯玉米Li等[24]光滑假絲酵母 Candida glabrata青貯玉米Li等[24]木蘭假絲酵母 Candida magnolia青貯玉米Li等[24]管道假絲酵母 Candida mesenterica青貯玉米Rossi等[19]

Wu等[13]在青貯苜蓿中分離出了食果糖乳桿菌(L.fructivorans)。王紅梅等[14]從呼倫貝爾草原牧草青貯飼料中分離得到5株乳酸菌菌株，分別為乳桿菌屬和片球菌屬(Pediococcusspp.)的植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糊精片球菌(Pediococusdextrinicus)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)和草乳桿菌(L.graminis)，其中植物乳桿菌產酸能力最強，發(fā)酵速度最快，耐酸和耐低溫能力較強，適宜用作呼倫貝爾地區(qū)青貯飼料乳酸菌添加劑的菌種。Wang等[18]從青貯飼料中分離出新的菌種并命名為臺灣乳桿菌(L.taiwanensis)。Rossi等[19]調查了農場的青貯飼料，主要是青貯玉米、苜蓿、黑麥草及其青貯玉米和玉米粒的混合物，除分離青貯玉米中已知的乳酸菌外，還發(fā)現(xiàn)了新菌種——玉米乳桿菌(L.zeae)；同時在這些青貯飼料中被發(fā)現(xiàn)的厭氧芽孢梭菌屬中，除了巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和軟化類芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)，其他大部分是已知的梭菌；在這些青貯飼料中，管道假絲酵母(Candidamesenterica)、假絲酵母(C.apicola)和畢赤酵母菌(Pichiafermentans)3種酵母種類被鑒定，其中管道假絲酵母、假絲酵母是首次被報道。Brusetti等[22]采用長度多態(tài)片段-PCR(LH-PCR)技術研究發(fā)現(xiàn),青貯玉米早期存在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)(發(fā)酵0和1 d)、魏斯氏乳酸菌(Weissellakimchi)(發(fā)酵6 d)和黃色腸球菌(Enterococcusflavescens)(發(fā)酵13 d)，這些菌種是首次在青貯飼料中報道。

2 青貯微生物接種劑作用機理及應用效果

2.1 青貯微生物接種劑常用種類及作用機制

青貯微生物接種劑通常分為4類：1)同型發(fā)酵乳酸菌，可快速降低pH、增加乳酸菌數(shù)量和乳酸含量；2)專性異型發(fā)酵乳酸菌，主要具有增加有氧穩(wěn)定性的作用；3)兼性異型發(fā)酵乳酸菌，具有兩者聯(lián)合的作用；4)其他微生物接種劑，也就是非乳酸菌接種劑(N-LAB)，如新型的微生物接種劑牛鏈球菌(Streptococcusbovis)-同型乳酸菌聯(lián)合、丙酸桿菌(Propionibacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌(yeast)，以上青貯微生物接種劑主要有促進發(fā)酵、抑制有氧惡化、改善營養(yǎng)和吸收等作用[23]。為彌補青貯原料附生菌(小于105CFU/g鮮物質)的不足，更好地促進青貯發(fā)酵，在制作青貯飼料時，應該添加菌劑使青貯飼料中發(fā)酵菌種不少于105CFU/g鮮質量，使青貯環(huán)境pH降低加快，更快進入發(fā)酵期。其作用機制是創(chuàng)造一個封閉的厭氧環(huán)境，添加適宜的微生物接種劑結合附著在牧草上的乳酸菌，可加快青貯發(fā)酵速度，增強乳酸菌的快速繁殖，使pH快速降低到3.8以下，產生的乳酸等有機酸能有效抑制其他微生物的生長繁殖，從而最大限度地減少營養(yǎng)物質的損失，提高牧草的能量轉化率，保持牧草鮮綠、芳香氣味的感官特性,改善反芻動物的適口性[2]。因此，在青貯飼料發(fā)酵調制過程中，添加適宜的接種菌劑可加快青貯發(fā)酵速度，改善青貯品質，提高其利用率，增強有氧穩(wěn)定性，有效提高動物的采食量。

2.2 青貯微生物接種劑對青貯飼料品質和有氧穩(wěn)定性的影響

近20年來，在世界大部分地區(qū)微生物接種劑已廣泛應用。青貯微生物接種劑產品大部分是同型發(fā)酵乳酸菌接種劑，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌、糞鏈球菌(E.faecium)、片球菌等。添加微生物接種劑的目的是在青貯發(fā)酵過程中快速、高效生產乳酸，可使pH更快降低，減少干物質和粗蛋白質的損失，保持青貯原料的營養(yǎng)價值和品質。然而，研究發(fā)現(xiàn)使用這些產品對青貯全株玉米有氧穩(wěn)定性會產生一定的負面影響，這可能是因為乙酸的減少。目前尋找一種同型發(fā)酵乳酸菌，既能以有機酸為主要發(fā)酵產物，又能保持青貯飼料不變敗的微生物接種劑是業(yè)內非常迫切的需求。

異型發(fā)酵乳酸菌來自于乳酸桿菌科中乳酸桿菌屬，如布氏乳桿菌(L.buchneri)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、乳球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏菌(Weissella)。布氏乳桿菌作為代表的微生物接種劑被廣泛應用，該菌株生長緩慢，即使在發(fā)酵期結束后也能從糖或乳酸中產生乙酸，乙酸的增加可以抑制酵母菌和霉菌的生長，延緩青貯飼料腐敗變質，進而改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。然而，這種微生物接種劑也存在一些缺陷，相比同型發(fā)酵乳酸菌，其生長較為緩慢，需要青貯50～70 d才能改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，因此，在青貯中添加布氏乳桿菌的特殊菌株和接種量還需要進一步研究，來彌補這些缺陷[25]。最近研究表明，新型的布氏乳桿菌-A KKP 2047p能將1,2-丙二醇轉化為丙酸，這有助于葡萄糖和維生素B12的生成[26]，但是青貯中天然存在的該菌株是否有這種轉化能力尚不清楚，有待進一步研究。布氏乳桿菌與傳統(tǒng)的微生物接種劑聯(lián)合應用，既可提高青貯飼料的品質和動物的生產性能，又能改善其有氧穩(wěn)定性。Guo等[27]利用單分子實時(SMRT)測序技術和代謝組學檢測在紫花苜蓿中添加同型發(fā)酵植物乳桿菌和異型發(fā)酵布氏乳桿菌的青貯飼料細菌群落動態(tài)變化和代謝特征，為青貯飼料發(fā)酵過程中微生物變化提供了生物信息，也為添加不同類型的微生物接種劑生產不同品質的青貯飼料提供了調控方法。

兼性和專性異型發(fā)酵乳酸菌聯(lián)合應用是一個微生物接種劑產品實現(xiàn)2種類型有益作用的重要途徑之一。兼性異型發(fā)酵乳酸菌控制發(fā)酵期間梭菌等有害菌的生成，降低粗蛋白質的水解和干物質的損失。專性異型發(fā)酵乳酸菌大部分布氏乳桿菌種類在青貯發(fā)酵后期由乳酸轉變乙酸較慢，可提高青貯pH和有氧穩(wěn)定性，從而使飼喂的動物在日增重和產奶量等生產性能上獲得提升。然而，目前飼喂添加聯(lián)合微生物接種劑的青貯飼料可以持續(xù)提高動物生產性能的作用尚不清楚。體外消化研究表明，青貯可以改善纖維的消化作用[28]，但在反芻動物體內是否有類似的有益作用還需進一步試驗來驗證。

對于新的微生物接種劑，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)與乳酸菌菌株在青貯使用中的作用非常相似，它是在瘤胃中認知和篩選的，而不是在青貯中發(fā)現(xiàn)的乳酸菌種，生長繁殖非?？?，20 min可增倍生長，比青貯乳酸菌菌種繁殖快。Ferreira等[29]在實驗室微貯象草中添加2株牛鏈球菌株進行60 d青貯，與未添加和添加糞腸球菌比較，牛鏈球菌株不僅降低了pH和氨氮含量，還減少了氣體和液體物的損失，從而增加了青貯干物質含量，因此，這2種菌株有望成為潛在的青貯熱帶牧草的接種菌株。枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是一種新開發(fā)的菌種，可通過產生具有抑制酵母和霉菌的細菌素來提高有氧穩(wěn)定性，已在青貯玉米[30]和青貯苜蓿中應用。最近，酵母菌如畢赤酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為一種新的青貯微生物接種劑已被報道[31]，具有抑制青貯有害菌的生成和減少有氧損失的作用，但是在青貯應用中很難控制其生長繁殖，這是阻礙其商業(yè)化的主要原因之一。研究表明，一些新發(fā)現(xiàn)的微生物接種劑可產生抗菌和抗霉菌化合物，能夠抑制多種青貯中有害菌和霉菌生成，為提升青貯飼料質量和減少青貯飼料使用過程中有害菌、有害物質生成提供了寶貴的微生物資源[30-31]。

2.3 青貯微生物接種劑對反芻動物生產性能的影響

青貯微生物接種劑的添加對青貯飼料品質具有積極的作用，而且可提高動物的生產性能。然而，目前有關青貯微生物接種劑提高動物生產性能的機理仍不清楚，在某些情況下，青貯飼料品質與動物的生產性能具有明顯的關系，但大部分是間接的關系，青貯飼料干物質消化率的改善與動物生產性能的提高可能有關。Ando等[32]研究發(fā)現(xiàn)，添加鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)青貯幾內亞牧草，可提高干物質和有機物的消化率，增加閹割公羊的攝食量。最近研究表明，青貯飼料添加菌劑可以改善動物的體外發(fā)酵。水稻全混合日糧接種植物乳桿菌株的體外研究表明，與未經(jīng)處理的全混合日糧青貯飼料相比，減少了甲烷的產生[33]。Ellis等[34]添加乳酸菌作為益生菌和發(fā)酵劑可增加瘤胃體外消化率，減少甲烷氣體的產生。Daniel等[35]添加混合同型發(fā)酵劑乳明串珠菌(L.lactis)、植物乳桿菌和屎腸球菌(E.faecium)接種玉米青貯飼料，可提高奶牛全混合日糧的消化率，并增加產奶量。這些結果表明，一些菌劑可以改變瘤胃發(fā)酵，無論是降低甲烷的產生還是增加瘤胃微生物的生物量，任何一種方式都可能提高動物的生產性能。對反芻動物生產者來說，提高生產效率是在青貯飼料中添加微生物接種劑的主要目的。但青貯微生物接種劑對反芻動物生產效率的影響了解甚少。因此，研究青貯微生物接種劑對反芻動物生產性能的影響是篩選和發(fā)掘微生物接種劑的關鍵，應該選擇可能增強瘤胃微生物活性的菌株，而不是在青貯期間只降低纖維素的菌株。當然，基于PCR新技術、代謝組學與體外發(fā)酵進行分析[27，36-37]，將有助于我們進一步深入研究和揭示青貯接種乳酸菌如何影響反芻動物的利用和生產性能。

4 結論與展望

我國對青貯飼料的研究起步較晚，特別是青貯微生物接種劑產品的研發(fā)和應用，與發(fā)達國家存在很大差距，這與我國“糧改飼”、反芻動物由粗放生產向集約化生產轉變的發(fā)展是極不相適的。近幾年來，我國奶牛、肉牛、肉羊等反芻動物生產突飛猛進，均需要優(yōu)質青貯飼料作為物質保障，但落后的青貯技術和缺少優(yōu)質的青貯微生物接種劑，成了制約反芻動物生產和降本增效的主要因素。隨著對青貯飼料品質需求的提升和化學腐蝕性青貯添加劑使用的減少，選擇無毒、無害、廉價、使用方便的青貯微生物接種劑是我國青貯產業(yè)發(fā)展的勢趨。目前，國外青貯微生物接種劑應用多年，也已進入我國青貯市場，而我國還沒有自主研發(fā)的優(yōu)質青貯微生物接種劑產品，所以亟待加強這方面的研究和開發(fā)。我們需采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結合現(xiàn)代分子生物技術(尤其是16S rRNA高通量第3代單分子和全基因測序技術、宏基因組學、代謝組學、轉錄組學等不斷更新的技術)，不斷認知青貯飼料資源中的新菌種，分離獲得優(yōu)良的微生物接種劑，為進一步改善青貯飼料品質和提高反芻動物的生產性能提供理論基礎和應用新思路。