骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)類型之間的本質(zhì)區(qū)別及生物學特征

張葆鑫，郝廷，楊曉龍，王興國

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

據(jù)相關研究顯示，疾病的發(fā)生多與外界因素和基因因素相關，而線粒體DNA（mtDNA）容易受到自由基的攻擊，并導致mtDNA突變，從而形成惡性循環(huán)，導致生理機能的衰退[1]。該次實驗選取2016年1—12月于該院就診的骨質(zhì)疏松癥患者共150例，并根據(jù)中醫(yī)辨證類型進行分組，著重了解骨質(zhì)疏松癥與中醫(yī)證型之間的關聯(lián)，討論其相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗選取于該院就診的骨質(zhì)疏松癥患者共150例，并根據(jù)中醫(yī)辨證類型進行分組，具體而言可分為肝腎陰虛證、脾腎陽虛證和氣滯血瘀證，每組50例。與此同時，選擇了50名非骨質(zhì)疏松癥的健康人群（氣血平和證）作為對照組進行分析?；颊吣挲g在50～63歲之間，且排除了患有繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的情況，所有患者均為自愿參與實驗，在年齡、病程等一般資料對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

首先，需要對所有患者進行血液標本采集，即在入院后的第二天進行空腹抽血，且抽血前一天晚上10點后禁食，抽血量為8 mL，共2管。其中，一管為干燥管，另一管為含有肝素鈉的抗凝管。干燥管樣本需要在2 h內(nèi)進行3 000 r/min離心20 min；肝素管需要搖勻，均放置于-70℃的低溫箱中等待檢測。在檢測方面，需要對mtDNA拷貝數(shù)進行相關檢測，并根據(jù)酶聯(lián)免疫法對8－羥基脫氧鳥苷酸濃度進行分析，其試劑盒批準號：201301。除此之外，我們將采用PCR對mtDNA的ND3基因和18S基因進行擴增曲線的測量，并計算閾值，其表達式為ΔΔCt=實驗組基因 ΔCt－對照組基因 ΔCt[2]。

1.3 觀察指標

在實驗中將對患者mtDNA拷貝數(shù)及8－羥基脫氧鳥苷酸（8－OHdG）的含量進行測定，并對比分析骨密度與mtDNA拷貝數(shù)及8－OHdG的相關性。8－OHdG濃度的檢測需要采用雙抗體夾心法，在HRP酶的作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，而在酸的作用下可轉(zhuǎn)換為黃色。其顏色可說明8－OHdG濃度的相關性，并計算具體值。除此之外，在mtDNA拷貝數(shù)的檢測方面將通過ABI 3 900臺式高通量DNA合成儀完成具體操作，并結(jié)合人線粒體NADH脫氫酶亞單位2以及18sRNA的基因序列進行分析。

1.4 診斷標準

在診斷上，我們將參照骨質(zhì)疏松癥的國際診斷標準，并測量骨密度 （BMD），即t值超過-1.0標準差（SD）則視為正常，t值介于-1.0SD和-2.5SD之間，則為骨量減少；當t值小于-2.5SD時則為骨質(zhì)疏松癥，當患者t值小于-2.5SD并合并骨折癥狀，則判定為嚴重的骨質(zhì)疏松癥組。

1.5 統(tǒng)計方法

對上述兩組患者各項記錄數(shù)據(jù)進行分類和匯總處理，采取SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對上述匯總數(shù)據(jù)進行分析和處理，計數(shù)資料采取百分率表示，計量資料采取均值±標準差（±s）表示，在連續(xù)變量的對比上采用 Pearson相關分析法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在mtDNA拷貝數(shù)結(jié)果上，肝腎陰虛組、脾腎陽虛組均低于氣血平和組，但是，氣滯血瘀組則表現(xiàn)出最高值，與其他兩組患者治療效果相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 與此同時，在 8－OHdG 的濃度對比上，骨質(zhì)疏松癥組各個中醫(yī)證型的患者其數(shù)值均低于氣血平和組，且脾腎陽虛組數(shù)值最高，肝腎陰虛組和氣滯血瘀組則無明顯差異，具體情況如表1所示。

在相關性分析上，mtDNA拷貝數(shù)與骨密度呈正相關，而8－OHdG與骨密度則呈負相關性，具體而言，在肝腎陰虛組中，相關系數(shù)為0.854，mt DNA拷貝數(shù)與骨密度為正相關性，而8－OHdG與骨密度相關系數(shù)為-0.862，則為負相關性，其他組別詳情見表2。

表1 各組間的mtDNA拷貝數(shù)比較情況（±s）

表1 各組間的mtDNA拷貝數(shù)比較情況（±s）

組別n2－ΔΔCt ρ8－OHd G/（ng·L-1）ρA，BMD/（g·cm-2）肝腎陰虛組（n=50）脾腎陽虛組（n=50）氣滯血瘀組（n=50）氣血平和組（n=50）0.851±0.454 0.844±0.846 1.451±0.748 1.208±1.228 196.54±40.32 218.36±47.33 198.35±38.25 178.63±84.69 0.635±0.014 0.702±0.055 0.701±0.048 1.365±0.124

3 討論

在中醫(yī)理論中，骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”的范疇，其最為主要的發(fā)病機制則是腎虛，并以血瘀作為病理基礎，兩者相互依存，共同作用引起質(zhì)變。在找準“腎虛血瘀”的病理機制后，我們對中醫(yī)證型進行了分別的討論實驗。據(jù)相關學者指出，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的病機主要是多瘀和多虛，因此得出了相應的四大類臨床證型，分別為：腎陽虛衰、肝腎陰虛、脾腎陽虛、氣滯血瘀，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學手段，進一步發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證型間的差異性，尋找實質(zhì)具有重要意義。

該次實驗研究的線粒體基因技術(shù)則為中醫(yī)證型的研究提供了新的方向，這也是對外界環(huán)境和基因共同作用的一次理論上的突破，是在內(nèi)外因素的共同干擾下得出新的結(jié)論。線粒體是體細胞的呼吸中心，而mtDNA作為唯一的核外遺傳物質(zhì)，其自身具有結(jié)構(gòu)上的特殊性，屬于細胞內(nèi)核外遺傳物質(zhì)。因此，容易出現(xiàn)損傷并導致突變現(xiàn)象。引起與mtDNA相關因子出現(xiàn)損傷的因素較為多樣、復雜，其中，最常見的則為氧化應激，直接會引起蛋白質(zhì)、DNA的氧化性損傷[4]，并加重患者病情，最終導致急性、慢性損傷。

8－OHdG則屬于活性氧族，是導致DNA氧化損傷的產(chǎn)物之一，也是DNA突變的標志。當患者出現(xiàn)缺血、缺氧問題，8－OHdG含量將出現(xiàn)一定程度的上升。而8－OHdG的產(chǎn)生主要依賴于患者體內(nèi)的活性氧，當活性氧不斷增加時，氧化應激過程所產(chǎn)生的ROS將會直接攻擊mtDNA，并生成8－OHdG。此時，由于mtDNA自我修復能力較差，且缺乏組蛋白的保護，因此容易導致退行性疾病。在該次實驗研究中，骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證型的三組患者的8－OHdG水平均高于健康組人群，進一步證明了骨質(zhì)疏松癥對患者造成的氧化損傷，且以脾腎陽虛癥患者最為突出。相對地，在骨密度的相關性研究結(jié)果中，脾腎陽虛證型的患者與8－OHdG的關聯(lián)最大。

從其他方面來看，線粒體NADH脫氫酶亞單位2基因能夠直接參與到呼吸鏈中，并參加了氫與電子之間的傳遞，可介入氧化磷酸化而生成ATP。在進一步檢測ND2基因的過程中，可以更為準確、直觀地反映mtDNA拷貝數(shù)。該基因已經(jīng)成為分析mtDNA損傷線粒體功能障礙的重要指標。據(jù)其他研究顯示，ND2基因突變與多種疾病相關，包括常見的高血壓、糖尿病等，其中最為肯定的疾病為帕金森和阿爾茨海默病。當mtDNA缺失數(shù)達到一定的臨界值時，則會導致細胞功能障礙，減退，該因素也成為判定衰老的分子生物學標志之一[5]。

綜上所述，線粒體DNA相關因子與骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證型存在一定的相關性，其中脾腎陽虛組與8－OHdG的相關性最高，肝腎陰虛組則與mtDNA拷貝數(shù)相關性最高。