WISP-1，β-catenin，L1CAM在食管鱗狀細胞癌中的表達及意義

蹇順海，陳筱莉，何琳莉，王莉，黃一凡，殷秀，文彬

(川北醫(yī)學(xué)院，1.病理學(xué)教研室；2.病理生理教研室，四川 南充 637000)

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)地區(qū)發(fā)病率約為0.05%，鱗狀細胞癌占90%。食管癌的發(fā)生是多基因、多途徑改變的結(jié)果，尋找敏感的分子標記，用于食管癌早期診斷，治療和判斷預(yù)后具有重要意義。Wnt誘導(dǎo)的分泌型蛋白1(Wnt-induced secreted protein-1，WISP-1))屬于CCN( cysteine rich 61/connective tissue growth factor/nephmblastoma overexpressed gene ) 家族的成員，在乳腺癌[1-2]、直腸癌[3]、腺樣囊性癌[4]等多種腫瘤中高表達，也是wnt/β-catenin信號通路的重要靶基因。細胞黏附分子L1(The L1 cell adhesion molecule，L1CAM)作為一種神經(jīng)細胞黏附分子，對神經(jīng)組織的發(fā)育與遷移起重要作用，在結(jié)腸癌，卵巢癌，肝內(nèi)膽管細胞癌中有較高表達，與腫瘤細胞的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，L1分子是β-catenin/TCF信號通路的靶基因。本研究通過免疫組化方法，以癌旁相對正常組織，食管癌組織為研究對象，檢測WISP-1，β-catenin，L1CAM在食管鱗狀細胞癌中的表達情況，探討其與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年6月至2009年6月食管癌根治術(shù)標本60例。全部臨床病理資料收集完整，術(shù)前活檢證實為食管鱗狀細胞癌，未行放、化療治療，術(shù)后標本完整。本組患者發(fā)病年齡40～77歲，中位年齡61.5歲，平均年齡60.4歲。男性39例，女性21例。另取57例癌旁(距癌灶3 cm，形態(tài)學(xué)無不典型增生)正常食管上皮作對照。

1.2 主要試劑

WISP-1及L1CAM均購自abcam公司，WISP-1系兔抗人多克隆抗體，稀釋比例1∶200；L1CAM為鼠抗人單克隆抗體，稀釋比例1∶100；β-catenin購自福州邁新生物技術(shù)公司，稀釋比例1∶100。

1.3 免疫組化染色

石蠟組織連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟后水化，En vision兩步法，DAB顯色在光鏡下嚴格控制顯色反應(yīng)。結(jié)果均以已知陽性標本為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐黃色顆粒為陽性信號，染色背景清晰，WISP-1定位于細胞質(zhì)和包膜；L1CAM定位于細胞膜。根據(jù)半定量方法劃分著色強度：陽性細胞數(shù)>50%為(3+)，20%～50%為(2+)，5%～20%為(1+)， <5%或不著色為(0)，前兩者為陽性表達，后兩者記為陰性表達。β-catenin彌漫表達于正常鱗狀上皮細胞胞膜，在癌細胞中，細胞膜不表達或低于70%的細胞膜陽性，定義為細胞膜表達缺失；當>10%癌細胞的細胞質(zhì)及細胞核陽性表達時，為異位表達，定義為過表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，3種蛋白表達之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

本組病例中，位于食管上段3例，中段36例，下段16例，同時累及食管中上段2例，中下段3例。按組織學(xué)分級，高分化25例，中分化29例，低分化6例。浸潤黏膜固有層、或黏膜肌及粘膜下層共9例，浸潤固有肌層23例，侵及外膜28例，。依據(jù)AJCC第7版食管癌的臨床病理分期，Ⅰa期6例，Ⅰb期6例，Ⅱa期14例，Ⅱb期 17例，Ⅲa期7例，Ⅲb期6例，Ⅲc 期3 例，Ⅳ期1例(肝轉(zhuǎn)移)。為便于分析，將Ⅰa期，Ⅰb合并為Ⅰ期，Ⅱa、b、c期合并為Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期合并為晚期組。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 食管癌組織中WISP-1，β-catenin與L1CAM的表達 60例食管鱗狀細胞癌中WISP-1(圖1)、β-catenin(圖2)、L1CAM(圖3)的陽性表達率或異常表達率分別為66.7%、100%和43.3%，其在癌旁組織的陽性表達率分別為9.6%、0和3.6%。3種蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 食管鱗癌組織與癌旁組織WISP-1、L1CAM表達情況比較

2.2.2 WISP-1，β-catenin與L1CAM的表達與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 WISP-1的表達與性別、浸潤深度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與腫瘤分化程度有關(guān)，高分化鱗癌表達比率和強度高于低分化癌。β-catenin表達與性別、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，與腫瘤分期相關(guān)，分期越高，表達缺失越多。L1CAM的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)，與性別無明顯相關(guān)性(表2)。

2.2.3 WISP-1，L1CAM與β-catenin在食管癌中表達的相互關(guān)系 食管鱗癌中WISP-1的表達與β-catenin異常表達無相關(guān)性。L1CAM與β-catenin異常表達有顯著相關(guān)性，β-catenin腫瘤細胞胞質(zhì)和核陽性者，前者的陽性細胞數(shù)和比例增高(r=-0.495，P<0.001)。見表3。

3 討論

WISP-1基因定位于8q24.1～8q24.3，編碼產(chǎn)物含367個氨基酸，含有4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。研究表明，WISP-1通過激活抗凋亡蛋白激酶B(Akt)信號途徑，抑制細胞色素C釋放，上調(diào)抗凋亡蛋白BCL-XL，封閉P53下游蛋白，從而阻止caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[5]。

本組病例中，WISP-1在食管鱗癌中的陽性率為66.7%，顯著高于癌旁組織。Nagai等[6]檢測了105例食管鱗癌WISP-1的表達情況，陽性表達率為56%，兩者陽性結(jié)果比較一致。Nagai等發(fā)現(xiàn)WISP-1的表達與食管癌的浸潤深度、病變大小，腫瘤生長方式、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。但本組結(jié)果僅顯示與食管癌的分化程度有關(guān)，可能與存在樣本偏差、樣本含量較少有關(guān)。本組病例中WISP-1在原位癌區(qū)域的表達強度也明顯高于癌旁組織。新近的研究顯示，口腔鱗狀細胞癌WISP-1的表達明顯高于癌旁正常組織并且其表達強度與低生存率相關(guān)。敲除口腔鱗狀細胞癌1483細胞株的WISP-1可以顯著降低細胞的侵襲能力并誘導(dǎo)癌細胞凋亡[7]。另有研究表明WISP-1可以通過反式激活EGFR/ERK/HIF-1-α通路，促進VEGF-A表達上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成[8]；通過調(diào)節(jié)VEGF-C的表達，誘導(dǎo)淋巴管生成，利于腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。這些研究結(jié)果提示W(wǎng)ISP-1過表達在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起了非常重要的作用。WISP-1可作為判斷腫瘤預(yù)后的標志物之一。

L1CAM基因定位于Xq28，全長25kb，含28個外顯子，編碼產(chǎn)物為200～220 KDa跨膜糖蛋白。L1CAM表達于正常神經(jīng)上皮，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。正常粘膜上皮一般不表達，在胃黏膜可呈弱表達，在胃癌[10]、膽管細胞癌[11]等惡性腫瘤中呈強表達。本組研究結(jié)果顯示L1在食管鱗癌中的陽性表達率為43.3%，且陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期密切相關(guān)。Guo等[12]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌(N=157)L1CAM的表達顯著高于正常組織，且與總生存率降低顯著有關(guān)。進一步研究表明，L1CAM通過活化整合素β1/MAPK/ERK/AP1信號通路，上調(diào)細胞骨架蛋白ezrin表達，ezrin蛋白參與細胞微絨毛的組成，對維持細胞形態(tài)，促進黏附和腫瘤轉(zhuǎn)移有重要作用。Hung等[13]發(fā)現(xiàn)L1在口腔鱗狀細胞癌中過表達，通過短發(fā)夾shRNA干擾L1CAM基因的的表達，可以顯著減少癌細胞增殖，同時降低癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Xu等[14]通過對中國人食管癌患者191例(正常對照組94例)血液循環(huán)L1CAM自身抗體的檢測，發(fā)現(xiàn)食管癌人群L1CAM自身抗體水平明顯高于對照組，敏感性為27.7%，特異性為91.5%，結(jié)果提示血液中L1CAM自身抗體可以作為早期發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌潛在的生物標志物。

β-catenin不僅是E-cadherin/catenin復(fù)合物的重要組成部分，還是wnt信號通路的關(guān)鍵成分，前者主要作用在于參與細胞與細胞、細胞與間質(zhì)之間的粘附，后者參與多種腫瘤的發(fā)生。結(jié)腸家族性腺瘤性息肉蛋白(APC)基因的失活、β-catenin 基因突變、或者Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，均可以導(dǎo)致β-catenin在細胞質(zhì)、胞核內(nèi)異常集聚，穩(wěn)定性增加。細胞核內(nèi)的β-catenin和DNA結(jié)合分子相互作用，激活下游基因如cyclin-D1、c-myc等，促使細胞分裂增殖，進而形成腫瘤。

本組試驗顯示β-catenin在食管癌的過表達率為28.3%，與劉莉等[15]的實驗結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)β-catenin表達與性別、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)，而與腫瘤分期相關(guān)。Situ等[16]報道β-catenin的表達與患者年齡、性別、腫瘤位置、大小、分化程度、浸潤深度及AJCC臨床病理分期無相關(guān)性，但與患者預(yù)后有關(guān)，β-catenin過表達比表達缺失患者的生存時間短，相對于T2-3N0M0期，β-catenin表達增高是一個預(yù)后不良的獨立因素。然而有關(guān)食管癌β-catenin的表達文獻報道并不一致，也有研究認為β-catenin表達降低或缺失與預(yù)后不良有相關(guān)性[17]，由于β-catenin對E-cadherin粘附功能的完整性是必須的，β-catenin表達減弱會降低細胞間的粘附性，致使腫瘤細胞分散，促進細胞運動和遷移，形成轉(zhuǎn)移。本組病例顯示β-catenin表達減弱或缺失多見于分化差的細胞，在Nozoe等[18]研究中，單因素分析發(fā)現(xiàn)食管鱗癌β-catenin低表達提示預(yù)后不良。綜上所述，β-catenin在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用十分復(fù)雜，表達下調(diào)或過表達均有助于食管鱗癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。不同的組織學(xué)類型、疾病發(fā)展不同階段等也許是β-catenin表達方式差異的原因，有必要在β-catenin基因水平進一步研究。

本組結(jié)果顯示β-catenin過表達與L1CAM增強有關(guān)。Gavert等[19]研究發(fā)現(xiàn)，將含有2.9kb轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游基因L1啟動子報告質(zhì)粒，與穩(wěn)定突變的β-catenin共轉(zhuǎn)染進結(jié)腸癌293細胞中，L1啟動子活性增強6倍。Pfeifer等[20]在子宮內(nèi)膜癌細胞株中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，上調(diào)β-catenin可增強L1啟動子活性。Kato等[21]研究認為當β-catenin在結(jié)腸癌細胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)集聚，可使L1的DNA中心啟動子及TCF結(jié)合位點發(fā)生低甲基化，致使L1異常表達。但在食管鱗癌中是否如此尚無文獻報道。

有研究將突變的β-catenin基因轉(zhuǎn)染至293細胞中，WISP-1啟動基因被激活，激活程度還與轉(zhuǎn)染突變β-catenin基因的數(shù)量有關(guān)系[22]，表明WISP-1是wnt/β-catenin信號通路的重要靶基因。但是本實驗結(jié)果顯示食管癌中WISP-1和β-catenin的表達沒有相關(guān)性，提示W(wǎng)ISP-1可能存在其他激活途徑。

總之，食管癌的發(fā)生是多基因、多步驟改變的結(jié)果，分子機制復(fù)雜。我們研究顯示W(wǎng)ISP-1 、L1CAM蛋白在食管癌中過表達，以及β-catenin異常表達均與食管癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。WISP-1，β-catenin，L1CAM對預(yù)測食管鱗狀細胞癌的生物學(xué)行為有一定價值，可能會是食管癌治療潛在的新靶點。然而，對食管癌中這三種蛋白的相互作用和分子機制進行更加深入地研究仍有必要。