突觸可塑性和軸突運(yùn)輸在痛覺(jué)過(guò)敏中的作用

楊菁，張從利

(西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710077)

痛覺(jué)過(guò)敏是神經(jīng)病理性疼痛的疼痛表現(xiàn)，指對(duì)正常刺激的敏感性增加[1]。疼痛感對(duì)自我保護(hù)、危險(xiǎn)識(shí)別和控制傷害的延長(zhǎng)等至關(guān)重要。然而，組織損傷、慢性炎癥和神經(jīng)病理學(xué)均可誘導(dǎo)傷害性神經(jīng)元可塑性，從而導(dǎo)致病理性疼痛。最終，疼痛成為疾病本身，失去了維持身體完整性的保護(hù)特性[2]。坐骨神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致的慢性壓迫性損傷已被廣泛用于研究神經(jīng)病理學(xué)疼痛的病理。因此，本研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic compression injury，CCI)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)性疼痛誘導(dǎo)模型[3]，檢測(cè)CCI術(shù)后大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏、冷觸誘發(fā)痛以及熱痛覺(jué)過(guò)敏隨時(shí)間的變化。目前，研究已經(jīng)確定了觸發(fā)神經(jīng)性疼痛發(fā)作的細(xì)胞和分子信號(hào)，但是慢性疼痛的自我修復(fù)機(jī)制在很大程度上還是未知的。研究[4]表明，突觸強(qiáng)度和功效的依賴(lài)性增加，最終導(dǎo)致神經(jīng)疼痛模型動(dòng)物的慢性機(jī)械性觸誘發(fā)痛。此外，軸突運(yùn)輸障礙可能導(dǎo)致軸突機(jī)械敏感性和機(jī)械超敏反應(yīng)[5]，此機(jī)制為疼痛的研究提供了新的思路。本研究主要從突觸可塑性以及軸突運(yùn)輸兩方面探討CCI術(shù)后痛覺(jué)過(guò)敏的機(jī)制，探討CCI對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)、神經(jīng)纖維粘附分子(NCAM1)、突觸后致密蛋白(PSD-95)、突觸體素(Syp)、驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)以及動(dòng)力蛋白(dynein)的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選用180～221 g成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在241 ℃的室溫下自由喂食和飲水，12/12光照/黑暗循環(huán)。將大鼠隨機(jī)分為兩組：Sham組(假手術(shù)組，n=20)，CCI組(坐骨神經(jīng)損傷組，n=20)。

1.2 建立坐骨神經(jīng)損傷模型

采用CCI誘導(dǎo)大鼠外周神經(jīng)性疼痛[3]。按體重對(duì)手術(shù)大鼠腹膜內(nèi)注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。在股肌肉下方做3～4 mm的深切，暴露坐骨神經(jīng)，并用無(wú)菌4-0腸線(xiàn)在4個(gè)連續(xù)位點(diǎn)進(jìn)行松扎，間隔為1 mm。假手術(shù)組：只暴露坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎。之后，兩組均立即絲線(xiàn)縫合肌肉和皮膚層，并應(yīng)用局部抗生素。所有外科手術(shù)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3 疼痛超敏反應(yīng)檢測(cè)

分別在術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d對(duì)大鼠進(jìn)行疼痛超敏反應(yīng)測(cè)試。

1.3.1 機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏 采用von Frey細(xì)絲評(píng)估機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏[6]。將大鼠放入高架金屬網(wǎng)底箱中，通過(guò)電子von Frey絲緩慢勻速向大鼠后肢足底表面施加壓力。記錄大鼠足退縮或后肢回縮時(shí)的壓力值，記為縮足反射閾值(PWT，g)。每組測(cè)量3次，間隔15 min，取3次平均值。

1.3.2 冷觸誘發(fā)痛 采用丙酮跌落試驗(yàn)檢測(cè)冷觸誘發(fā)痛[7]。將大鼠放入高架金屬網(wǎng)底箱中，向大鼠后爪足底表面噴灑100 μL丙酮。記錄大鼠縮足持續(xù)時(shí)間(c-PWL，sec)。每組測(cè)量3次，間隔15 min，取3次的平均值。

1.3.3 熱痛覺(jué)過(guò)敏 采用Eddy’s熱板評(píng)估熱痛覺(jué)過(guò)敏[8]。保持溫度在(52.51.0)℃，記錄大鼠撤回后爪或舔爪的時(shí)間，記為后爪熱縮足反射閾值(h-PWL，sec)。為避免后爪受傷，設(shè)置15 s為截止時(shí)間。每組測(cè)量3次，間隔15 min，取3次的平均值。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析

CCI后14 d，分別取兩組各10只大鼠同側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)(DRG)進(jìn)行qRT-PCR分析。剩余大鼠繼續(xù)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，CCI后21 d，取兩組各剩余的10只大鼠DRG進(jìn)行qRT-PCR分析。用Trizol試劑(Invitrogen，USA)從DRG中分離總RNA。2 μg總RNA依照High-Capacity RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems，USA)合成cDNA。按照說(shuō)明書(shū)，使用特異性引物、SYBR Green I 試劑和RT-PCR試劑盒，在Bio-Rad iQ5定量PCR系統(tǒng)(Takara，中國(guó))上檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平。相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)2-DΔCt方法計(jì)算。采用內(nèi)參基因GAPDH定量靶基因。采用Primer-BLAST在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCI對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏的影響

圖1A和圖1C顯示，術(shù)前1 d，兩組間PWT和h-PWL均無(wú)顯著差異。從術(shù)后1 d開(kāi)始至術(shù)后14 d，CCI組大鼠的PWT和h-PWL均隨時(shí)間的增加而逐漸降低，且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上與Sham組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CCI組大鼠的PWT和h-PWL在術(shù)后21 d均比術(shù)后14 d時(shí)增加。

圖1B顯示，術(shù)前1 d，兩組間c-PWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從術(shù)后1 d開(kāi)始至術(shù)后14 d，CCI組大鼠的c-PWL隨時(shí)間的增加而逐漸增加，且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上與Sham組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CCI組大鼠的c-PWL在術(shù)后21 d均比術(shù)后14 d時(shí)降低。

2.2 CCI對(duì)突觸可塑性的影響

圖2A和圖2B顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中GAP-43和NCAM1的表達(dá)增加(P<0.01)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d相比，GAP-43和NCAM1的表達(dá)均下降(P<0.01,P<0.05)，但未恢復(fù)至正常水平。

圖2C和圖2D顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中PSD-95和Syp的表達(dá)均降低(P<0.05)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d相比，PSD-95和Syp的表達(dá)均增加(P<0.05)，但尚未恢復(fù)至正常水平。

2.3 CCI對(duì)軸突運(yùn)輸?shù)挠绊?/h3>

圖3顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中kinesin和dynein的表達(dá)均降低(P<0.05)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d對(duì)比，kinesin和dynein的表達(dá)增加(P<0.01)，且高于正常水平。

3 討論

本研究旨在從突觸可塑性和軸突運(yùn)輸兩方面探討大鼠坐骨神經(jīng)CCI后的神經(jīng)機(jī)制。有研究[3]報(bào)道，CCI誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)顯著改變，此作用在神經(jīng)損傷后約2周觀(guān)察到最大效應(yīng)。因此，本研究評(píng)價(jià)在CCI后21 d內(nèi)痛覺(jué)過(guò)敏指標(biāo)，對(duì)冷觸誘發(fā)痛的檢測(cè)，噴灑丙酮后，大鼠的正常反應(yīng)是快速退回爪子，迅速放置在網(wǎng)絲上。而在神經(jīng)性疼痛大鼠中，其后爪縮回并放置在網(wǎng)絲上的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，因此通過(guò)測(cè)量縮足持續(xù)時(shí)間(c-PWL，sec)評(píng)估后爪對(duì)丙酮的冷觸誘發(fā)痛。結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d開(kāi)始出現(xiàn)PWT和h-PWL隨時(shí)間的增加而逐漸降低，在術(shù)后14 d 時(shí)到達(dá)低谷，21 d時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。這表明坐骨神經(jīng)損傷后大鼠對(duì)機(jī)械性傷害的敏感程度增強(qiáng)，對(duì)熱刺激的耐受降低。坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d開(kāi)始出現(xiàn)PWT和h-PWL隨時(shí)間的增加而逐漸降低，在術(shù)后14 d時(shí)到達(dá)低谷，21 d時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。c-PWL在坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d隨時(shí)間的增加而增加，在術(shù)后14 d時(shí)到達(dá)峰值，21 d時(shí)開(kāi)始降低。這表明坐骨神經(jīng)損傷后大鼠對(duì)由冷刺激誘發(fā)的疼痛的維持時(shí)間增加。

研究表明，DRG可能是痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)中受損的器官之一，且神經(jīng)損傷可以誘導(dǎo)DRG中基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)展[9]。因此，本研究主要以DRG為研究對(duì)象，探討CCI后14 d和21 d DRG中突觸可塑性和軸突運(yùn)輸指標(biāo)的變化。

神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43是主要存在于神經(jīng)生長(zhǎng)錐和突觸前末梢的一種細(xì)胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白。蛋白激酶C可以磷酸化GAP-43的絲氨酸41(Ser41)位點(diǎn)，磷酸化的GAP-43通過(guò)穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白微絲調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)、出芽以及突觸重塑[10]。研究[11]表明，GAP-43 mRNA的表達(dá)在舌下神經(jīng)橫斷后2周內(nèi)達(dá)到最高峰值，然后逐漸降低。這與本研究結(jié)果一致，在CCI后14 d GAP-43 mRNA的表達(dá)顯著增加，而CCI后21 d顯著降低，表明CCI 2周后，機(jī)體的損傷修復(fù)基本完成。神經(jīng)纖維粘附分子NCAM1是調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)突生長(zhǎng)、細(xì)胞間相互作用和突觸可塑性的蛋白質(zhì)[12]。研究表明，NCAM1參與周?chē)窠?jīng)損傷誘導(dǎo)激活前扣帶皮層對(duì)特定突觸蛋白翻轉(zhuǎn)的持續(xù)增強(qiáng)這一過(guò)程，且NCAM1介導(dǎo)脊柱重組，有助于行為敏化。周?chē)窠?jīng)結(jié)扎后，突觸后密度部分的NCAM1水平顯著增強(qiáng)[13]。本研究顯示，在CCI后14 d NCAM1 mRNA的表達(dá)顯著增加，而此時(shí)痛覺(jué)過(guò)敏癥狀亦最為顯著，而CCI后21 d NCAM1 mRNA表達(dá)顯著降低。

突觸可塑性的中心為興奮性突觸，而興奮性突觸的突觸后位點(diǎn)是由突觸后致密蛋白(PSD)附著于突觸后膜上形成的[14-15]。研究[16]表明，海馬神經(jīng)元中PSD-95的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)突觸成熟，特別是谷氨酸能突觸的成熟。本研究顯示，在CCI后14 d PSD-95 mRNA的表達(dá)顯著降低，表明由于坐骨神經(jīng)的損傷，在損傷后14 d只有少量PSD-95附著于突觸后膜，傳遞興奮。而CCI后21 d PSD-95 mRNA表達(dá)顯著增加，提示神經(jīng)損傷修復(fù)增加，大量PSD-95附著于突觸后膜，形成興奮性突觸的突觸后位點(diǎn)，傳遞興奮。Syp是一種鈣結(jié)合糖蛋白，作為含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸前小泡的整體跨膜蛋白組分被發(fā)現(xiàn)[17]，其主要參與突觸小泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程，已被廣泛認(rèn)為是突觸密度的標(biāo)記[18]。研究[19]表明，在坐骨神經(jīng)CCI后，Syp蛋白的表達(dá)峰值出現(xiàn)在損傷后14 d，有趣的是，本研究結(jié)果顯示，CCI后14 d Syp mRNA的表達(dá)顯著降低，而CCI后21 d顯著增加，表明CCI 14 d內(nèi)突觸小泡的融合以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等神經(jīng)信息傳遞過(guò)程受到損傷，而14 d后，此過(guò)程逐漸恢復(fù)。因此，關(guān)于CCI后Syp表達(dá)隨時(shí)間的變化，還有待進(jìn)一步詳細(xì)研究。

軸漿運(yùn)輸?shù)陌l(fā)生有賴(lài)于馬達(dá)蛋白中的驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)和動(dòng)力蛋白(dynein)水解ATP所產(chǎn)生的能量[20]。Kinesin將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和dynein從胞體運(yùn)輸?shù)绞軗p的軸突遠(yuǎn)端(順向流動(dòng))，dynein到達(dá)軸突遠(yuǎn)端后，再直接或者間接和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸至胞體(逆向流動(dòng))[21]。本研究結(jié)果顯示，CCI后14 d kinesin和dynein mRNA的表達(dá)顯著降低，表明在坐骨神經(jīng)損傷后14 d內(nèi)，軸突運(yùn)輸發(fā)生障礙。在CCI 14 d內(nèi)，由于神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白如GAP-43和NCAM1的增加，修復(fù)受損的神經(jīng)元，為軸突運(yùn)輸和突觸傳遞提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但由于突觸小泡蛋白Syp以及突觸后膜致密部位蛋白PSD-95在CCI后14 d內(nèi)的降低，表明此時(shí)突觸后膜的結(jié)構(gòu)還不夠完善，突觸小泡的融合以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放還存在障礙，導(dǎo)致不能傳遞興奮。這些可能是由于此時(shí)kinesin和dynein蛋白表達(dá)降低，沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此不足以維持神經(jīng)元重塑的能量消耗。而CCI后21 d kinesin和dynein mRNA表達(dá)增加，同時(shí)Syp和PSD-95的表達(dá)亦增加，表明該時(shí)神經(jīng)元重塑已啟動(dòng)，而神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的修復(fù)已接近尾聲，因此GAP-43和NCAM1的表達(dá)降低。

總之，本研究表明CCI后14 d，大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏、冷觸誘發(fā)痛以及熱痛覺(jué)過(guò)敏達(dá)到最大效應(yīng)，14 d后開(kāi)始緩解。GAP-43和NCAM1在CCI后14 d內(nèi)顯著增加，損傷14 d后降低，而Syp、PSD-95、kinesin和dynein在CCI后14 d內(nèi)顯著降低，損傷14 d后增加。這提示坐骨神經(jīng)損傷14 d內(nèi)，主要以修復(fù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)為主。而損傷14 d后，突觸小泡的融合、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、興奮的傳遞以及軸突運(yùn)輸啟動(dòng)，而此時(shí)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的修復(fù)已接近尾聲。