白藜蘆醇對(duì)痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Sirtuin 1表達(dá)的影響

楊其彬，何泳龍，鐘曉武，青玉鳳，謝文光，周京國(guó)

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所，四川 南充 637000；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 成都 610000)

痛風(fēng)作為尿酸代謝異常所致的疾病，通過(guò)大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇有降尿酸活性，其機(jī)制可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制黃嘌呤氧化酶活性而實(shí)現(xiàn)的[1]，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。除此之外，白藜蘆醇在膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎及兔實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好的抗炎效果[2-3]。研究表明，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中大量的促炎癥因子如白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等明顯增高[4]。王鵬等[5-6]在尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中已證實(shí)白藜蘆醇能夠明顯的降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、趨化因子CCR5水平及滑膜核因子(NF)-κB p65蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇可以減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥程度，但其抗炎機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

Sirtuin (SIRT) 蛋白家族是哺乳動(dòng)物與沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)同源的一個(gè)進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)家族，在人類(lèi)分別命名為SIRT1～7[7]。白藜蘆醇作為SIRT1天然激動(dòng)劑，Howitz等[8]在2003年最先證實(shí)了白藜蘆醇是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)SIRT1的活性，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。在炎癥反應(yīng)中，NF-κB的p65亞單位是SIRT1的直接靶點(diǎn)，SIRT1通過(guò)去乙酰化作用降低NF-κB p65的乙?；綇亩种破鋵?duì)于下游因子的轉(zhuǎn)錄功能[9]。Takada等[10]將白藜蘆醇與不同非甾體抗炎藥物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有很強(qiáng)的抗炎活性，SIRT1可以明顯減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生以減弱炎癥反應(yīng)。由此可見(jiàn)，SIRT1在調(diào)控炎癥反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

朱小霞等[11]進(jìn)行SIRT1在常見(jiàn)風(fēng)濕性疾病中的研究進(jìn)展綜述表明，骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等病中SIRT1表達(dá)明顯降低，而提高SIRT1活性能明顯緩解病情；也有少數(shù)研究者存在不同觀點(diǎn)，活動(dòng)性狼瘡患者血CD4+T細(xì)胞及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞中的SIRT1表達(dá)水平明顯升高。SIRT1的生物學(xué)功能作用多樣，而白藜蘆醇是否活化SIRT1調(diào)控痛風(fēng)患者炎癥反應(yīng)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文從免疫炎癥的角度以人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)為研究樣本，檢測(cè)了痛風(fēng)患者不同期的SIRT1基因及蛋白表達(dá)水平，體外不同濃度白藜蘆醇干預(yù)尿酸鹽晶體(MSU)刺激間歇期痛風(fēng)患者誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)的SIRT1、IL-1β蛋白及NF-κB p65 mRNA水平的變化，探討白藜蘆醇參與痛風(fēng)炎癥調(diào)控機(jī)理及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選擇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2014年1月至2014年11月收治的痛風(fēng)急性期(AG)患者48例，均符合1977年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn)；痛風(fēng)間歇期(IG)患者40例，均為AG后至少2周、血沉和CRP正常者，排除痛風(fēng)石形成、尿酸鹽腎病及尿酸性尿路結(jié)石患者?；颊呔鶠槟行裕珹G組年齡17～74歲，平均(49±12)歲，病程(7±5)年；IG組年齡24～67歲，平均(44±12)歲，病程(11±6)年。對(duì)照組為80例男性健康體檢者，年齡23～65歲，平均(46±11)歲，均無(wú)痛風(fēng)家族史、心腦血管病史、感染等炎癥疾病，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無(wú)異常。3組性別、年齡具有可比性。

1.1.2 主要試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，熒光染料試劑盒(ABI公司，USA)，兔抗人SIRT1(CST)，兔抗人GAPDH(北京康為世紀(jì))，二抗為山羊抗兔IgG(中杉金橋)，低溫高速離心機(jī)5417R(美國(guó)Eppendorf公司)，7900 Real-Time PCR儀(美國(guó)ABI公司)，白藜蘆醇(美國(guó)sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇配制 濃度為99%白藜蘆醇粉末用二甲基亞砜(DMSO)充分溶解，配成200 μmol/L儲(chǔ)存液，正壓過(guò)濾除菌分裝，-20℃保存，使用濃度根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐渲撇煌臐舛取?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激 不同濃度白藜蘆醇干預(yù)MSU刺激6例間歇期痛風(fēng)患者外周靜脈血，根據(jù)白藜蘆醇不同濃度(0、100、200、400 μmol/L)及空白對(duì)照分為五組，100 μg/mL MSU聯(lián)合白藜蘆醇(0、100、200、400 μmol/L)于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h后分離血漿及PBMCs，血漿分裝后在-80 ℃凍存?zhèn)溆?，收集的PBMCs用于提取RNA及制備細(xì)胞蛋白。

1.2.3 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法。SIRT1、NF-κB p65及內(nèi)參β-actin基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，SIRT1上游：5’-GGTATTTATGCTCGCCTTGC-3’，下游：5’-CCTGTTCCAGCGTGTCTAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度115bp；NF-κB p65上游：5’-GTGGGGACTACGACCTGAAT-3’，下游：5’-GGGGCACGATTGTCAAAGAT-3’；β-actin上游：5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’，下游：5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度128 bp。取肝素鈉抗凝外周靜脈血3 mL，人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離PBMCs，Trizol試劑提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qPCR為25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各1 μL 10 pmol/L引物，2 μL cDNA，8.5 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔。所有擴(kuò)增均在ABI 7900 Real-Time PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為△Ct，2-△Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)水平。所有標(biāo)本均重復(fù)檢測(cè)2次取均值。

1.2.4 蛋白檢測(cè) 采用Western blot方法。分別提取AG、IG及HC組PBMCs總蛋白各6例，并進(jìn)行BCA蛋白濃度定量，取等量蛋白上樣量，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(SIRT1、IL-1β、GAPDH稀釋度均為1∶1 000)，二抗室溫孵育1 h(二抗稀釋度1∶3 000)，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，使用Fusion Fx5曝光成像，Image J軟件對(duì)顯影條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，SIRT1/GAPDH、IL-1β/GAPDH灰度值作為目的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)變化特點(diǎn)

本研究分別使用熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)痛風(fēng)患者SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，熒光定量PCR檢測(cè)所有標(biāo)本均重復(fù)2次并取均值， AG、IG和HC 3組SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.89，P<0.05)；組間比較發(fā)現(xiàn)，SIRT1 mRNA在AG、IG患者的表達(dá)水平顯著低于HC(t=2.76，2.47；P分別<0.01，0.05)，而AG與IG比較顯示，AG患者SIRT1 mRNA更低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1A)。Western blot檢測(cè)痛風(fēng)患者AG、IG和HC 3組SIRT1蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.01，P<0.001)，組間比較發(fā)現(xiàn)AG、IG組SIRT1蛋白水平顯著低于HC組(t=9.40，3.53；P分別<0.01，0.05)，AG組SIRT1表達(dá)水平顯著低于IG組(t=5.87，P<0.01)(圖1B)。

2.2 白藜蘆醇促進(jìn)尿酸鹽晶體刺激痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)

為明確白藜蘆醇對(duì)SIRT1功能的改變特點(diǎn)，本文檢測(cè)了不同濃度白藜蘆醇干預(yù)MSU刺激間歇期痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白水平。SIRT1 mRNA在各組間存在有顯著差異(F=2.91，P<0.05)，MSU聯(lián)合200 μmol/L和400 μmol/L濃度白藜蘆醇組較MSU組、空白對(duì)照顯著升高(P<0.01)，其余各組無(wú)顯著差異(圖2A)；MSU刺激組的SIRT1蛋白水平較空白對(duì)照顯著降低(t=7.51，P<0.01)，200 μmol/L和400 μmol/L的白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組顯著升高(t=5.48，10.27；P均<0.01)，而100 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合MSU組SIRT1較MSU組有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。

2.3 白藜蘆醇降低尿酸鹽晶體刺激痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-1β蛋白水平

IL-1β作為痛風(fēng)炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵促炎因子，我們檢測(cè)了不同濃度白藜蘆醇干預(yù)MSU刺激間歇期痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-1β蛋白水平。IL-1β蛋白水平在各組間存在有顯著差異(F=136.6，P<0.001)，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)MSU刺激組的IL-1β蛋白水平較空白對(duì)照顯著升高(t=20.8，P<0.01)，200 μmol/L和400 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組顯著降低(t=9.96，7.81；P均<0.01)，100 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組無(wú)顯著差異(t=0.19，P>0.05)(圖3)。

2.4 白藜蘆醇降低尿酸鹽晶體刺激痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB p65 mRNA水平

SIRT1在炎癥反應(yīng)中通過(guò)作用于NF-κB的p65亞單位來(lái)抑制炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄。本文研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組、MSU刺激組以及MSU聯(lián)合不同濃度白藜蘆醇組的NF-κB p65 mRNA水平存在顯著差異(F=32.02，P<0.001)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，MSU刺激組的NF-κB p65 mRNA水平較空白對(duì)照顯著升高(t=7.65，P<0.01)，而NF-κB p65 mRNA水平在200 μmol/L和400 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組顯著降低(t=6.25，6.00；P均<0.01)，而100 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合MSU組較MSU組無(wú)顯著差異(t=1.51，P>0.05)(圖4)。

3 討論

痛風(fēng)病名中醫(yī)文獻(xiàn)早有記載，屬痹癥范疇，中醫(yī)對(duì)痛風(fēng)病機(jī)的認(rèn)識(shí)，多數(shù)認(rèn)為本病的病機(jī)是“濕”和“熱”，治療用藥多以化濕、清熱為主。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)多為復(fù)合方劑，其中藥物種類(lèi)復(fù)雜，各種藥物有效成分、作用機(jī)理不明確，甚至一些具有較大有毒成分，故亟需各種類(lèi)似西藥具有明確藥理、毒理的中醫(yī)藥物。國(guó)外大量的研究證實(shí)白藜蘆醇是葡萄酒(尤其是紅葡萄酒)中最重要的功效成分之一，經(jīng)現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有如抗腫瘤、降血壓、抗動(dòng)脈硬化、抗血小板聚集、抗細(xì)菌和真菌感染、抗氧化、抗自由基、抗炎、退燒與止痛等多種藥理活性[12]。痛風(fēng)急性發(fā)作期最常見(jiàn)中醫(yī)證型為濕熱蘊(yùn)結(jié)證，白藜蘆醇具有清熱解毒、健脾胃的功效。研究表明白藜蘆醇對(duì)膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎均有良好的抗炎效果[2-3]，而且白藜蘆醇參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用已成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。

白藜蘆醇，化學(xué)名3，5，4’-三羥基-反-1，2-二奔乙烯(3，5，4’-trihydroxystilbene)或稱(chēng)芪三酚，廣泛存在于虎杖、花生、桑椹等各種植物中。研究表明，在痛風(fēng)炎癥反應(yīng)過(guò)程中伴隨大量的活性氧(ROS)的產(chǎn)生氧化過(guò)程，ROS能夠被核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3 (NLRP3)炎性體識(shí)別，炎性體活化釋放促炎因子，引起炎癥反應(yīng)[13]。環(huán)氧化酶2(COX-2)是氧化應(yīng)激過(guò)程的主要成員之一，白藜蘆醇對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠有明顯的抑制作用，并呈一定的劑量依賴(lài)性，其作用可能是通過(guò)抑制IL-1β的分泌及關(guān)節(jié)滑膜NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥過(guò)程中相關(guān)信號(hào)通路，減少炎癥因子及趨化因子的生成[2]。研究表明，SIRT1主要通過(guò)去乙?；傅幕钚园l(fā)揮其生物學(xué)功能，廣泛作用于各種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，如蛋白53(p53)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)、解耦聯(lián)蛋白(UCP2)、NF-κB等[14-15]。SIRT1與不同的底物相互作用，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，白藜蘆醇能夠活化SIRT1通過(guò)去乙?；种芅F-κB轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制NLRP3基因轉(zhuǎn)錄達(dá)到限制NLRP3炎性體活性，這可能是白藜蘆醇抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。本文研究發(fā)現(xiàn)，急性期和間歇期痛風(fēng)患者的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照者(圖1)，這與骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等常見(jiàn)風(fēng)濕病的SIRT1低水平表達(dá)相一致[11]，提示痛風(fēng)患者SIRT1低水平表達(dá)不能有效抑制MSU誘導(dǎo)的炎癥因子轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，急性期、間歇期痛風(fēng)患者SIRT1 mRNA均呈低表達(dá)且無(wú)明顯差異，但急性期痛風(fēng)患者SIRT1蛋白水平較間歇期患者降低更明顯，急性期患者SIRT1基因與蛋白表達(dá)水平不一致，提示基因從轉(zhuǎn)錄到蛋白翻譯過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后調(diào)控等多種機(jī)制可能發(fā)揮了重要作用，例如微小RNA、甲基化、乙酰化等，需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制。

先前文獻(xiàn)報(bào)道[8]白藜蘆醇通過(guò)激活SIRT1調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)一步明確白藜蘆醇是否能改變痛風(fēng)患者SIRT1水平及其變化特點(diǎn)，本文通過(guò)體外功能研究不同濃度白藜蘆醇干預(yù)MSU刺激間歇期痛風(fēng)患者全血誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)，檢測(cè)其外周血單個(gè)核細(xì)胞SIRT1水平，研究顯示MSU可下調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，而白藜蘆醇能夠從基因和蛋白水平上調(diào)SIRT1表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)性(圖2)。本研究結(jié)果提示白藜蘆醇可能通過(guò)上調(diào)SIRT1表達(dá)參與抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。IL-1β作為痛風(fēng)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中關(guān)鍵細(xì)胞因子，其水平可反映痛風(fēng)炎癥程度或強(qiáng)度，本研究檢測(cè)了下游促炎因子IL-1β蛋白在不同濃度白藜蘆醇干預(yù)MSU刺激間歇期痛風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的變化，研究結(jié)果顯示白藜蘆醇能夠明顯抑制IL-1β蛋白水平，呈濃度依賴(lài)性(圖3)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2,9,16]，白藜蘆醇活化SIRT1后通過(guò)抑制NF-κB p65亞基活性發(fā)揮生物學(xué)功能。本文進(jìn)一步檢測(cè)了NF-κB p65 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇呈濃度依賴(lài)性抑制NF-κB p65 mRNA水平(圖4)，我們的結(jié)果進(jìn)一步表明白藜蘆醇通過(guò)濃度依賴(lài)性抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)，之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持本文研究[2-3]。

綜上，白藜蘆醇呈濃度依賴(lài)性上調(diào)SIRT1水平抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)，提示SIRT1是白藜蘆醇抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的作用靶點(diǎn)，這有助于更深入闡明白藜蘆醇參與痛風(fēng)的炎癥調(diào)控機(jī)制及白藜蘆醇治療痛風(fēng)奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)痛風(fēng)的診斷、治療和預(yù)防都具有重要意義。