西藏大麥黃矮病病毒株系鑒定及介體蚜蟲(chóng)傳毒能力分析

姚小波，王文峰，李 楊，劉何春，雷雪萍，龐 博，次仁央拉

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000)

大麥黃矮病(Barley Yellow Dwarf Virus，簡(jiǎn)稱BYDV)是最重要、分布最廣的禾谷類病毒[1]，包括小麥和燕麥等禾谷類作物的主要病害之一。大麥黃矮病病毒由蚜蟲(chóng)以持續(xù)性方式傳播，病毒在蚜蟲(chóng)體內(nèi)可存活2～3周，感染植株的韌皮部組織后，細(xì)胞大量增殖[2]，引起葉片增厚、發(fā)黃。依據(jù)蚜蟲(chóng)傳播效率與介體?；?，將BYDV劃分成PAV、MAV、RMV、SGV、RPV 5個(gè)株系，不同株系由不同種類麥蚜傳播[3]。每種蚜蟲(chóng)只對(duì)其中的1個(gè)株系最有效，麥二叉蚜專化性傳播SGV分離物，麥長(zhǎng)管蚜?；詡鞑AV分離物，禾谷縊管蚜專化性傳播RPV分離物，禾谷縊管蚜和麥長(zhǎng)管蚜兩種蚜蟲(chóng)均能有效傳播PAV分離物，玉米蚜能有效傳播RMV分離物[4]。在我國(guó)，Zhou等[5]鑒定出GPV、GAV、PAV和RMV 4種株系。我國(guó)大麥黃矮病株系主要有RPV、GAV、PAV 3種，禾谷級(jí)管蚜傳播的RPV株系；麥二叉蚜、麥長(zhǎng)管蚜傳播的GAV株系；禾谷縊管蚜和麥長(zhǎng)管蚜傳播的PAV株系[6]，近幾年我國(guó)的主流株系為GAV株系。青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，又稱裸大麥，生產(chǎn)上大部分品種對(duì)BYDV抗性差，在西藏各冬、春青稞種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，拉薩、山南尤為嚴(yán)重。黃矮病一般造成青稞減產(chǎn)15 %左右，青稞早期發(fā)生黃矮病試驗(yàn)記載平均損失為55 %，甚至可達(dá)100 %。

利用系統(tǒng)性殺蟲(chóng)劑控制蚜蟲(chóng)是減輕黃矮病傳播流行的重要方法，使用耐病或抗病品種是防治大麥黃矮病最有效的措施，因此明確不同地區(qū)大麥黃矮病毒株系，有針對(duì)性地培育抗耐病品種是十分必要的。近年來(lái)，西藏拉薩、山南麥黃矮病發(fā)生日趨嚴(yán)重，而關(guān)于該地區(qū)大麥黃矮病毒株系類型、介體蚜蟲(chóng)傳毒能力尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)西藏青稞的黃矮病病株進(jìn)行了血清學(xué)鑒定和介體蚜蟲(chóng)傳毒能力分析，以期明確該區(qū)域的大麥黃矮病毒株系類型和蚜蟲(chóng)傳毒能力，為我區(qū)青稞抗黃矮病育種工作和田間防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 青稞田蚜蟲(chóng)種類調(diào)查

從秋季開(kāi)始至第2年夏結(jié)束，從拉薩曲水縣、山南桑日縣青稞黃矮病發(fā)生區(qū)定點(diǎn)系統(tǒng)調(diào)查。5點(diǎn)取樣,不定期從田間采集蚜蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)室隔離標(biāo)記飼養(yǎng)，進(jìn)行種類鑒定。

1.2 病株采集與保存

2016年5月10～15日，從拉薩、山南不同發(fā)病區(qū)采集典型新鮮病株，選取山南桑日縣冬青稞(冬青18)疑似病株4份，編號(hào)sn1、sn2、sn3、sn4；選取拉薩曲水縣冬青稞(冬青18)疑似病株6份，編號(hào)ls1、ls2、ls3、ls4、ls5、ls6，用于病毒株系鑒定。

1.3 生物學(xué)測(cè)定

1.3.1 傳毒蚜蟲(chóng)及毒源 在無(wú)毒青稞苗上飼養(yǎng)試驗(yàn)蚜蟲(chóng)，所產(chǎn)若蚜連續(xù)多代飼養(yǎng)獲得無(wú)毒蚜蟲(chóng)，作為實(shí)驗(yàn)蚜蟲(chóng)。BYDV-GAV毒源由課題組采集、分離、保存。

1.3.2 飼毒與接種 試驗(yàn)盆種植冬青稞冬青18，養(yǎng)蟲(chóng)籠隔離培植無(wú)毒苗。用無(wú)毒蚜取食感毒青稞，在15 ℃、黑暗條件下，培養(yǎng)2 d獲毒，幼苗2葉期接種感毒成蚜蟲(chóng)3頭，傳毒3 d，噴灑殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉徹底殺死接種麥苗上蚜蟲(chóng)，以不接蟲(chóng)為對(duì)照(CK)，充分發(fā)病后調(diào)查病株率。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

PAV、SGV、RPV、GAV抗血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組提供，飽和硫酸銨法提純IgG，用堿性磷酸酯酶標(biāo)記IgG，采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附方法(即DAS-ELISA法)[7]。接種PAV和GAV株系的青稞感病品種“冬青18”為陽(yáng)性對(duì)照，它們的健株為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥黃矮病的田間癥狀及蚜蟲(chóng)種類鑒定

感病植株葉片從葉邊緣、葉尖或葉片中間出現(xiàn)不均勻退色斑，褪色區(qū)域呈鮮黃色，點(diǎn)片狀不均勻褪色是黃矮病最典型特征之一[8]。一般從新葉下1～2片葉開(kāi)始黃化，自上而下，自葉尖沿葉脈向葉身擴(kuò)展，逐漸變窄、變厚、質(zhì)脆，葉背有蠟質(zhì)光澤。拔節(jié)期發(fā)病，植株不矮化。孕穗期發(fā)病，僅葉發(fā)黃，自尖端向下逐漸延伸，根系不健全，主根短，次生根少(圖1)。

經(jīng)拉薩、山南多點(diǎn)、多次田間采樣及室內(nèi)飼養(yǎng)，通過(guò)體形、體色、腹管、翅中脈、尾片毛(根)等形態(tài)特征鑒別，主要有麥長(zhǎng)管蚜[Sitobion avenae(Fabricius)]、禾谷縊管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnaeus)]和麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜[Metopolophiumdirhodum(Walker)]3種(圖2)。

2.2 大麥黃矮病病毒株系血清學(xué)鑒定

利用BYDV-PAV、GAV、RPV抗血清對(duì)待測(cè)10份標(biāo)樣株系測(cè)定，以毒源GAV、RPV、PAV分離物為陽(yáng)性對(duì)照，健康麥葉作為陰性對(duì)照。經(jīng)鑒定，拉薩曲水6份樣本與GAV抗血清有強(qiáng)反應(yīng)，OD值在0.031～2.331之間，平均為1.102，陰性健株對(duì)照值0.027，GAV陽(yáng)性對(duì)照1.034，而與RPV、PAV 2種抗血清無(wú)反應(yīng)，曲水青稞上黃矮病病毒流行株系為GAV。山南桑日縣4份標(biāo)樣與毒源GAV、RPV、PAV分離物抗血清無(wú)特異反應(yīng)，標(biāo)樣無(wú)我國(guó)大麥黃矮病流行株系。

圖1 西藏大麥黃矮病的田間癥狀

圖2 西藏常見(jiàn)3種麥蚜

圖3 電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 RT-PCR驗(yàn)證

以標(biāo)樣總RNA為模板，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性質(zhì)粒，陰性對(duì)照為無(wú)菌水，設(shè)計(jì)大麥黃矮病GAV CP基因特異引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，樣品和陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)條帶，陰性對(duì)照無(wú)此條帶的出現(xiàn)(圖3)，BYDV ELISA檢測(cè)與RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果相符，GAV株系是拉薩大麥黃矮病主要株系。

2.4 蚜蟲(chóng)傳毒能力比較

拉薩、山南3種蚜經(jīng)純化后，獲得無(wú)毒的麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜、麥長(zhǎng)管蚜、禾谷縊管蚜，在相同的條件下，飼毒接種，第25天開(kāi)始發(fā)病到第40天病癥明顯。拉薩、山南兩地的麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜、禾谷縊管蚜不傳播GAV株系黃矮病病毒。麥長(zhǎng)管蚜對(duì)黃矮病GAV株系的傳毒能力強(qiáng)，拉薩、山南兩地麥長(zhǎng)管蚜傳GAV株系的能力無(wú)差異。

3 結(jié) 論

我們對(duì)西藏地區(qū)的10份樣品經(jīng)血清學(xué)鑒定，拉薩曲水采集6份冬青18樣本為黃矮病，經(jīng)DAS-ELISA法檢測(cè)，RT-PCR法驗(yàn)證，拉薩曲水青稞黃矮病病毒株系為GAV株系。西藏拉薩、山南麥蚜種群田間調(diào)查，該地區(qū)蚜蟲(chóng)種群為麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜、麥長(zhǎng)管蚜、禾谷縊管蚜。傳播的GAV株系的媒介昆蟲(chóng)是麥長(zhǎng)管蚜，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)大量的禾谷縊管蚜、麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜，是大麥黃矮病其它株系媒介昆蟲(chóng)，是否存在其它病毒株系，尚需多點(diǎn)采樣進(jìn)一步分離鑒定。

表1 常見(jiàn)麥蚜的鑒別特征

表2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

表3 拉薩、山南3種蚜蟲(chóng)成蚜傳播GAV株系能力比較表

注：傳毒能力用發(fā)病株數(shù)與接種總株數(shù)的比值表示。