自噬對(duì)移植后MSCs生存影響及中藥干預(yù)作用的研究進(jìn)展*

李程豪，劉永琦，駱亞莉，伍志偉

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000；2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 兼具自我更新和多間質(zhì)分化的能力，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞組織再生[1]，已成為多個(gè)領(lǐng)域細(xì)胞替代治療和組織工程學(xué)的首選種子細(xì)胞[2]。雖然MSCs移植對(duì)眾多疾病的治療作用備受重視，但其還存在許多問(wèn)題制約其在臨床中的應(yīng)用。首先，移植部位的特殊環(huán)境使MSCs很難長(zhǎng)期存活；其次，MSCs在這些環(huán)境中的生存機(jī)制不明，影響了對(duì)有效保證其生存藥物的選擇[3]。以上均是干細(xì)胞治療應(yīng)用于臨床需要解決的問(wèn)題。

自噬是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一種自我保護(hù)機(jī)制，當(dāng)有外界刺激因素存在時(shí)，細(xì)胞可以通過(guò)啟動(dòng)自噬來(lái)減輕外在的刺激作用，使細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定的生理狀態(tài)，生物學(xué)穩(wěn)定性得以維持[4]，對(duì)移植后的細(xì)胞存活密切相關(guān)[5]。因此，一定程度的自噬作用對(duì)移植干細(xì)胞在特殊環(huán)境中存活并且持續(xù)增殖具有重要意義[6-7]。傳統(tǒng)中藥及其有效成分具有對(duì)特殊環(huán)境中細(xì)胞生物學(xué)形狀的調(diào)控作用，但部分作用機(jī)制尚不明確[8]。將傳統(tǒng)中藥與自噬間的相互關(guān)系運(yùn)用于干細(xì)胞的研究中，這可能是解決特殊環(huán)境中MSCs生存等一些列問(wèn)題的新思路。但目前對(duì)于自噬與干細(xì)胞在這些環(huán)境中生存關(guān)系及相關(guān)中藥的干預(yù)作用尚不清楚。本文將針對(duì)自噬對(duì)干細(xì)胞移植中可能存在應(yīng)激環(huán)境中的影響及中藥干預(yù)作用進(jìn)行討論。

1 應(yīng)激條件下細(xì)胞自噬的雙重性

圖1顯示，自噬作為細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的生理機(jī)制，在正?；蚴遣±頎顟B(tài)下均有發(fā)生[6]。但是干預(yù)條件的差異，使自噬對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)具有雙重調(diào)節(jié)性。特殊環(huán)境會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)也極易誘發(fā)自噬作用的改變。自噬作為一種細(xì)胞的防御機(jī)制，可以通過(guò)自噬小體對(duì)受損細(xì)胞器及DNA進(jìn)行吞噬，并被降解成為小分子物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量，使其內(nèi)環(huán)境處于相對(duì)穩(wěn)態(tài)[9-10]。然而不論是應(yīng)激信號(hào)的作用強(qiáng)度或是持續(xù)時(shí)間，均能對(duì)自噬程序活化的最終結(jié)果造成較大影響。應(yīng)激信號(hào)高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間的刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬過(guò)度，引起自噬體堆積。在自噬壓力的影響下，細(xì)胞凋亡更易發(fā)生[11]。

圖1 自噬對(duì)細(xì)胞的雙重性

2 缺血性疾病與MSCs自噬及中藥的影響

對(duì)于缺血性疾病的治療多是從開(kāi)通血管、改善血供、提高血液利用率等方面考慮，這些方法僅局限于保證血流的再灌注。而干細(xì)胞一方面可以分化生成新生組織及血管[12]，另一方面可通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子對(duì)其組織及血管進(jìn)行修復(fù)[13]，因此干細(xì)胞治療逐漸成為缺血性疾病的理想治療方法。Rigol[14]在心梗梗死部位注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)室壁厚度增加，移植的細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，有效地促進(jìn)了心肌功能的恢復(fù)。雖然干細(xì)胞在缺血性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景，但在缺血缺氧條件下移植后存活率較低的問(wèn)題仍制約了其臨床應(yīng)用。

2.1 缺血缺氧與氧化應(yīng)激對(duì)MSCs自噬的影響

多項(xiàng)研究證實(shí)，在營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺血缺氧等條件下，自噬會(huì)被激活參與多種疾病的病理生理活動(dòng)[15-16]。通過(guò)電鏡可以發(fā)現(xiàn)，新生兒相對(duì)缺氧心肌細(xì)胞存在大量自噬小體[17]。線粒體自噬在腦缺血早期被激活，可抑制缺氧環(huán)境下線粒體途徑引起的MSCs凋亡,而這種保護(hù)作用可以通過(guò)激活JAK2/PI3K/AKT/STAT3信號(hào)通路而產(chǎn)生[18]。但同時(shí)自噬也是引發(fā)缺氧環(huán)境中MSCs凋亡發(fā)生的重要因素。當(dāng)BMSCs分別在缺氧、血清剝奪環(huán)境中培養(yǎng)6、12、24 h后發(fā)現(xiàn)，自噬可引發(fā)凋亡并呈時(shí)間依賴性[16]，提示缺血缺氧環(huán)境不僅能夠引發(fā)自噬，長(zhǎng)時(shí)間作用將誘發(fā)自噬性凋亡。

在缺血性疾病中，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致再灌注損傷以及過(guò)度自噬發(fā)生[19]。經(jīng)過(guò)20 min缺氧干預(yù)的心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬小體且逐步增多，供氧恢復(fù)后自噬小體的數(shù)量進(jìn)一步增加[20]。相比較缺血階段，自噬現(xiàn)象在再灌注階段更加明顯，甚至導(dǎo)致過(guò)度自噬引起細(xì)胞死亡和組織損傷。在再灌注損傷過(guò)程中，自噬的發(fā)生主要包括兩方面因素，一是氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的大量自由基造成線粒體損傷，二是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生大量錯(cuò)誤折疊蛋白[21]。因此，在眾多因素的疊加作用下，氧化應(yīng)激可誘發(fā)過(guò)度自噬引起再灌注損傷。

2.2 中藥通過(guò)自噬對(duì)MSCs生存的影響

恰當(dāng)?shù)淖允勺饔脤?duì)缺氧缺血環(huán)境中的MSCs生存至關(guān)重要，甚至可能是MSCs在缺血缺氧環(huán)境中提高存活率的新策略[15]。AMPK-mTOR-ULK1通路的激活，可促進(jìn)缺氧階段保護(hù)性自噬發(fā)生，而Akt-Bcl2-Beclin1通路可以抑制復(fù)氧階段過(guò)度自噬，促進(jìn)MSCs在缺氧復(fù)氧環(huán)境中的生存和功能[22]。吳茱萸堿可通過(guò)JNK通路激活自噬，維持中風(fēng)性缺血環(huán)境中神經(jīng)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[23]。中藥對(duì)于自噬引起的再灌注損傷同樣有調(diào)控作用。在缺血干預(yù)1.5 h、再灌注24 h后的小鼠腦組織中，經(jīng)人參皂苷干預(yù)后腦組織細(xì)胞自噬活性受到控制，且梗死面積更少，神經(jīng)元更完整[24]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黨參具有抑制自噬的作用，其主要成分黨參多糖(codonopsis pilosula polysaccharide，CPPS)能夠在缺血再灌注損傷中調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的自噬作用，防止小鼠腦組織損傷[25]。

3 電離輻射與MSCs自噬及中藥的影響

在腫瘤治療研究中，生物治療越來(lái)越受到關(guān)注。MSCs具有免疫原性低、腫瘤趨向性及易于導(dǎo)入各種基因的優(yōu)良特性[1]，常作為靶向抗癌基因或藥物載體運(yùn)用于腫瘤生物治療的研究中，并擁有廣泛的應(yīng)用前景[26]。但目前在腫瘤的治療手段中多以放療為主，并輔以生物治療。因此，作為生物治療的重要載體，MSCs在電離輻射環(huán)境中是否能夠存活是其發(fā)揮載體功能的前提。

3.1 電離輻射對(duì)MSCs自噬的影響

細(xì)胞在電離輻射條件下DNA會(huì)發(fā)生損傷，大量活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)在胞內(nèi)過(guò)量堆積對(duì)細(xì)胞造成傷害[27]。為保護(hù)細(xì)胞，對(duì)抗損傷，多種防御機(jī)制啟動(dòng)，包括通過(guò)激活細(xì)胞自噬降解損傷的細(xì)胞器，緩解廢物堆積對(duì)細(xì)胞的傷害[28]。如果自噬受到抑制，放射性治療所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS堆積和DNA損傷將無(wú)法得到及時(shí)清除和修復(fù)，會(huì)嚴(yán)重影響MSCs生物學(xué)功能[27]。輻射可以通過(guò)ERK、AMPK等通路激活細(xì)胞自噬活性[ 29]。MSCs通過(guò)啟動(dòng)自噬功能，能對(duì)電離輻射所損傷的細(xì)胞器進(jìn)行清除，有效地減少ROS堆積，同時(shí)緩解細(xì)胞 DNA損傷，因此受到電離輻射后的MSCs大部分依然能夠存活。

電離輻射可以誘導(dǎo)MSCs自噬和凋亡發(fā)生，在細(xì)胞中可同時(shí)觀察到胞漿中自噬泡的積聚以及胞核中染色質(zhì)的濃縮聚集，兩者可先后發(fā)生或同時(shí)存在[30]。大量研究證實(shí)，自噬是凋亡的啟動(dòng)因素之一，即當(dāng)細(xì)胞受到放射刺激后，啟動(dòng)自噬機(jī)制作為存活途徑之一，但當(dāng)損傷超過(guò)了一定程度時(shí)，過(guò)度的自噬則會(huì)激活凋亡程序，發(fā)生不可逆的程序性死亡[31]。

3.2 中藥通過(guò)自噬對(duì)輻射影響

自噬受到抑制后，輻射對(duì)MSCs增殖與分化能力抑制作用明顯。細(xì)胞通過(guò)自噬可緩解輻射對(duì) MSCs 自我更新和分化能力的傷害，干性將得到有效維持[32]。 陳哲[33]等通過(guò)放射干預(yù)經(jīng)過(guò)自噬激動(dòng)劑雷帕霉素誘導(dǎo)的骨髓MSCs發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ蛋白高表達(dá)，保護(hù) MSCs 不受放射損傷。在輻射條件下，部分中藥有效成分可起到對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。烏蘇酸不僅能通過(guò)AMPK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，還可以誘導(dǎo)提高 MAPK 信號(hào)通路下游通路JNK的磷酸化水平激活自噬[34]。人參皂苷也能通過(guò)對(duì)細(xì)胞自噬的激活作用，減輕電離輻射引起的細(xì)胞損傷[35]。

4 炎癥環(huán)境中MSCs的自噬作用

干細(xì)胞在炎癥相關(guān)疾病中應(yīng)用廣泛。腸道炎癥會(huì)導(dǎo)致腸道損傷，Zhang Q[36]等將MSCs移植于損傷局部后，其通過(guò)參與修復(fù)、促進(jìn)微循環(huán)重建等途徑對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)。將BMMSCs移植到哮喘模型小鼠氣管內(nèi)，氣道炎癥反應(yīng)、肺損傷程度均明顯減輕[37]。因此，具有正常生物學(xué)特性的MSCs對(duì)炎癥性相關(guān)疾病相關(guān)損傷修復(fù)的應(yīng)用前景廣闊。但種植于炎癥部位的MSCs通常會(huì)遇到存活率較低等問(wèn)題，制約了MSCs在炎癥相關(guān)疾病中的應(yīng)用研究[38]。

4.1 炎癥對(duì)MSCs自噬的影響

應(yīng)激因素能夠誘導(dǎo)MSCs自噬作用發(fā)生改變。在炎性環(huán)境中，炎性因子可以誘導(dǎo)MSCs自噬發(fā)生。自身免疫性腦脊髓炎小鼠的BMMSCs具有較高的自噬活性，在炎性因子作用下，自噬成為調(diào)控MSCs 生物學(xué)功能的途徑之一[39]。炎性因子γ干擾素對(duì)人胎盤(pán)來(lái)源的 MSCs 胞內(nèi)自噬體的形成有明顯刺激作用[40]。炎性因子可以通過(guò)AMPK、NF-KB、AKT、ERK等經(jīng)典炎性通路調(diào)控自噬活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)[41-42]。但是過(guò)度的炎性因子刺激會(huì)造成細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)過(guò)度，不但無(wú)法保護(hù)細(xì)胞還會(huì)加速細(xì)胞凋亡[30]。

4.2 中藥通過(guò)自噬對(duì)炎癥影響

大量研究發(fā)現(xiàn)，在眾多炎癥相關(guān)疾病中，中藥有效成分能夠?qū)?xì)胞的自噬起到調(diào)節(jié)作用，而細(xì)胞自噬可以對(duì)炎癥環(huán)境中炎性因子的產(chǎn)生造成影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在中藥提取物白藜蘆醇的干預(yù)作用下，血管內(nèi)皮炎所造成的炎癥和損傷均減弱；而在炎癥部位，促炎因子TNF-α表達(dá)降低明顯，同時(shí)檢測(cè)到臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVecs)自噬作用顯著。提示中藥提取物白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬降低促炎因子的產(chǎn)生，減輕炎癥作用[43]。中藥提取物黃連素在對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路激活誘導(dǎo)自噬發(fā)生，局部巨噬細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生受到抑制，炎癥反應(yīng)程度降低[44]，提示中藥有效成分能夠通過(guò)對(duì)自噬作用的調(diào)節(jié)來(lái)影響炎癥反應(yīng)。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，在缺血缺氧、電離輻射和炎癥等應(yīng)激環(huán)境中，自噬對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用：在應(yīng)激因素的誘導(dǎo)下，細(xì)胞自噬作用加強(qiáng)，并通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞器及DNA進(jìn)行自我吞噬而產(chǎn)生能量，使細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)[10]；但是刺激過(guò)度也會(huì)導(dǎo)致自噬的不斷加強(qiáng)，最終引起細(xì)胞的程序性死亡。因此，適量的自噬對(duì)應(yīng)急條件下間充質(zhì)干細(xì)胞的生存有一定的積極作用，過(guò)量的自噬將加速其凋亡[11]。因此，自噬作用的調(diào)節(jié)對(duì)于移植后間充質(zhì)干細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境中的存活十分重要。而且在不同的條件下，需要根據(jù)具體的情況對(duì)自噬進(jìn)行激活或抑制，提示自噬在 MSCs 生物學(xué)功能的調(diào)控具有一定的復(fù)雜性。

而傳統(tǒng)中藥在現(xiàn)代化學(xué)實(shí)驗(yàn)、生物信息分析的支持下，體現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生物特性良好的調(diào)控作用[8]。部分中藥及其有效成分能夠通過(guò)對(duì)自噬的調(diào)控來(lái)提高間充質(zhì)干細(xì)胞移植的存活率，將極大地促進(jìn)其在臨床上的應(yīng)用。同時(shí)，通過(guò)對(duì)自噬與干細(xì)胞相關(guān)特性關(guān)系的了解，將有利于進(jìn)一步對(duì)傳統(tǒng)中藥的挖掘，也是研究新藥物的新方向。