痰熱清注射液對慢性阻塞性肺病急性加重期痰熱壅肺證患者腸道微生物多樣性的影響*

劉 璇，張治國，魏 娟，童要志，趙晶晶，趙小鵬，王 波，白 雯，喬樹斌△

(1. 北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸科，北京 100072；2. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)在我國40歲以上人群中患病率高達8.2%，居全球死亡原因第4位[1]。COPD多屬于中醫(yī)學“咳嗽”“喘病”“肺脹”等范疇。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)以痰熱壅肺證最常見[2]。痰熱清注射液作為清熱化痰法的代表方，在臨床治療中取得了一定的療效[3]。但目前中藥臨床研究多圍繞其臨床療效和抗炎反應[4]，尚未見到從腸道微生物多樣性角度探討痰熱清注射液對AECOPD痰熱壅肺證患者的影響。本研究基于中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論，擬探討痰熱清注射液對AECOPD痰熱壅肺證患者腸道微生物多樣性的影響。

1 資料

1.1 一般資料

表1顯示，痰熱壅肺型AECOPD患者全部來源于北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科病房。本研究共納入患者12例，其中聯(lián)合治療組6例，對照組6例，其中男9例，女3例，年齡最小59歲，最大85歲。改良英國呼吸困難指數(shù)(modified british medical research council，mMRC)評分最低2分，最高4分。COPD評估測試(COPD assessment test，CAT)評分最低14分，最高32分。中醫(yī)癥狀評分參照《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[5]“喘病”病證相關標準計算，最低20分，最高58分。2組患者性別差異明顯，治療組均為男性。治療組有3名患者伴呼吸衰竭，在疾病嚴重程度上治療組重于對照組。2組患者年齡、mMRC、CAT、中醫(yī)癥狀基線評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 納入病例一般情況比較

1.2 納入標準

1.2.1 納入診斷標準 西醫(yī)診斷標準參照我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[6]制定。診斷標準：危險因素接觸史；慢性咳嗽、咳痰、呼吸困難者；應用支氣管舒張劑后FEV1/FVC<70%，確定為不完全可逆性氣流受限者。嚴重程度分級：Ⅱ級(中度)：FEV1/FVC<70%，F(xiàn)EV1≥50%且FEV1%<80%；Ⅲ級(重度)：FEV1/FVC<70%，F(xiàn)EV1%≥30%且FEV1%<50%；Ⅳ級(極重度)：FEV1/FVC<70%，F(xiàn)EV1%<30%。AECOPD的診斷標準：在COPD病程中有或無明顯誘因，患者呼吸道癥狀迅速惡化，表現(xiàn)為咳喘加重、咳痰和呼吸困難程度加重，痰量增多，呈膿性或黏液膿性等炎癥明顯加重表現(xiàn)，可伴或不伴發(fā)熱，這些表現(xiàn)超出患者日常變異。

中醫(yī)證候診斷標準：符合西醫(yī)診斷標準、中醫(yī)辨證屬痰熱壅肺證。主癥：咳嗽，喘息，胸悶，痰多，痰黃、白黏干，咯痰不爽，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。次癥：胸痛，發(fā)熱，口渴喜冷飲，大便干結(jié)，舌苔厚。診斷標準：①咳嗽或喘息氣急；②痰多色黃或白黏，咯痰不爽；③發(fā)熱或口渴喜冷飲；④大便干結(jié)；⑤舌質(zhì)紅、舌苔黃或黃膩，脈數(shù)或滑數(shù)。具備①②2項加③④⑤中的2項。

1.2.2 納入標準 符合上述中西醫(yī)有關本病的診斷標準；男女不限，40歲<年齡<90歲；肺功能分級(吸入支氣管舒張劑后)Ⅱ-Ⅳ級者；愿意接受本方案的要求并配合治療的觀察者。

1.2.3 排除標準 不符合中醫(yī)辨證者；孕婦對痰熱清注射液過敏者；合并有心血管、肝腎及造血系統(tǒng)嚴重原發(fā)疾病者,精神病患者；合并肺部其他嚴重原發(fā)性疾病者；依從性較差、語言交流障礙者，正參與其他臨床試驗者。

1.2.4 剔除標準 病例選擇不符合納入標準，符合診斷標準；在隨機分組之后無任何數(shù)據(jù)記錄；臨床資料不完整、影響統(tǒng)計分析者。

1.2.5 脫落病例標準 受試者主動退出；依從性差不能繼續(xù)配合治療觀察；發(fā)生嚴重不良反應者。

脫落病例的處理：當受試者脫落后,研究者應完成所能完成的評估項目；治療無效或出現(xiàn)臨床不良反應的患者，應根據(jù)患者病情予以相應治療措施并退出試驗研究；脫落病例均妥善保存有關試驗資料，按照無效病例進行意向和統(tǒng)計學分析。

1.3 隨機化分組與分配隱藏

采用隨機數(shù)字表簡單隨機分組將患者分為聯(lián)合治療組和對照組。制作不透光的隨機分組信封，順序號貼在信封外面，隨機號及組別則密封于信封內(nèi)實現(xiàn)分配隱藏。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布者組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 方法

2.1 對照組

常規(guī)西醫(yī)綜合治療，包括抗感染(哌拉西林他唑巴坦聯(lián)合左氧氟沙星)、解痙平喘、化痰，必要時糖皮質(zhì)激素治療，14 d為1個療程。

2.2 聯(lián)合治療組

在對照組基礎上再聯(lián)合使用痰熱清注射液治療。痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn))40 mL/次，qd，14 d為1個療程。

2.3 觀察指標

2.3.1 mMRC評分[6]呼吸困難評分(Modified Medical Research Council Dyspnea Scale)。

2.3.2 CAT評分[6]慢性阻塞性肺疾病評估測試量表。

2.3.3 中醫(yī)癥狀評分 參照《中藥新藥臨床研究指導原則試行》“喘病”病證相關標準計算[5]。

2.3.4 不良反應 隨時記錄不同治療方案治療中出現(xiàn)的不良反應，如出現(xiàn)時間、程度、處理措施、經(jīng)過等并計算不良反應率。

2.3.5 腸道微生物多樣性分析 分別留取治療前后第7天清晨患者糞便標本，采用無菌通便的方法采集糞便，用無菌棉簽挑取新鮮糞便放入無菌凍存管后立即速凍，送至實驗室提取DNA，余糞便樣本-80 ℃保存。DNA提取采用PowerFecalTMDNA Isolation Kit(MoBio公司，美國)試劑盒提取100 mg糞便樣本中微生物總DNA，具體步驟按說明書操作。所提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用提取的總DNA作為模板，16 s PCR引物由測序接頭引物、Index和V3區(qū)引物3部分組成。Index為6 bp核苷酸隨機組成的序列，以標記PCR產(chǎn)物的來源。將純化后16s rRNA-V3 區(qū)的PCR產(chǎn)物送至清華大學醫(yī)學院進行測序，測序平臺為Illumina Miseq(Illumina，美國)。

3 結(jié)果

3.1 mMRC評分

表2顯示，在治療第7天及第14天，2組治療后mMRC評分均較治療前降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.2 CAT評分

表2顯示，2組分別于治療后第7天及第14天前后進行比較，CAT評分均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在治療第7天后，治療組評分下降較對照組明顯，說明治療組在改善CAT評分上有優(yōu)于對照組的趨勢。

3.3 中醫(yī)癥狀評分

表2顯示，在治療第7天及第14天后，中醫(yī)癥狀評分均明顯降低(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 mMRC、CAT及中醫(yī)癥狀評分比較

注：治療后與治療前比較：*P<0.05，**P<0.01

3.4 不良反應

整個研究期間未發(fā)現(xiàn)不良反應。

3.5 腸道微生物多樣性分析

3.5.1 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA) 圖1顯示，利用I-Sanger生物信息云平臺對2組患者腸道微生物進行PLS-DA分析，觀察2組患者腸道微生物個體或群體差異。經(jīng)分析表明，2組患者腸道微生物群落構成可明顯區(qū)分開來，治療組腸道菌群較集中，對照組菌群離散度大，治療組腸道菌群穩(wěn)定性優(yōu)于對照組。

3.5.2 組間相似性分析 圖2顯示，為觀察組間和組內(nèi)差異對樣本進行ANOSIM，即組間相似性分析表明，對照組組內(nèi)樣本差異較大，大于組間樣本差異，說明對照組樣本個體差異較大，聯(lián)合用藥組樣本腸道微生物分布較對照組相對穩(wěn)定。

圖1 2組患者腸道微生物樣本PLS-DA分析

圖2 2組患者腸道微生物樣本組間相似性分析

圖3 2組樣本微生物群落豐度分析

圖4 2組樣本豐度差異顯著的微生物

3.5.3 微生物群落豐度分析 圖3顯示，組間差異顯著性檢驗是根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運用嚴格的統(tǒng)計學方法檢測不同組(樣本)微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異物種進行假設性檢驗，評估觀察到差異的顯著性。在菌群科分類水平上，治療組和對照組在不同菌群豐度上存在差異，其中2組Bacteroidaceae的豐度差異較明顯，治療組多于對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義。治療組豐度最高的3種細菌為Bacteroidaceae(41.97%)、Ruminoco-ccaceae(14.11%)、Lachnospiraceae(12.77%)。對照組豐度最高的3種細菌為Prevotellaceae(16.78%)、Enterobacteriaceae(16.39%)、Entero-coccaceae(15.1%)。

圖4顯示，為進一步發(fā)掘2組豐度有差異的菌群，采用LEfSe分析表明，聯(lián)合用藥組和對照組豐度差異顯著的微生物，在“屬”的水平上分別是g__Enterobacter(腸桿菌屬)、g__Eubacterium(真菌屬)和g__Eggerthella(放線菌屬)，在“科”的水平上是f__Eubacteriaceae(真桿菌科)。

4 討論

從組織胚胎學角度，呼吸組織與腸道組織在胚胎發(fā)育時的結(jié)構來源是相同的，胚胎發(fā)育的同源性提供了COPD腸道微生態(tài)失衡的病理結(jié)構基礎[7]。腸道微生物的生理作用包括物質(zhì)代謝、促進結(jié)腸上皮的增殖和分化、生物屏障、免疫等，如雙歧桿菌、乳酸桿菌有增強免疫、消化、抗腫瘤感染及生成多種維生素、消除內(nèi)毒素的作用。人體的免疫、消化、代謝等多方面均受腸道菌群微生態(tài)失衡的影響。正常狀態(tài)下，腸道內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌等微生物相互依存、制約維持平衡。病理狀態(tài)下，腸道菌群微生態(tài)失衡，大量增加的格蘭氏陰性桿菌會釋放大量腸源性內(nèi)毒素，入血后經(jīng)下腔靜脈回到右心房，經(jīng)肺動脈和毛細血管灌流到肺臟，造成肺內(nèi)毒素損傷，促進COPD的發(fā)生發(fā)展[8]。

腸道菌群移位有3個基本要素，即腸道黏膜屏障受損、細菌過度繁殖和宿主免疫預防能力下降[9]。慢性阻塞性肺病急性加重期機體免疫力低下，腸道黏膜屏障作用減弱，繼發(fā)桿菌感染，并通過門靜脈進入血液導致內(nèi)毒素血癥[10]。長期抗生素的應用，導致腸內(nèi)部分寄生菌的生長受到抑制，格蘭氏陰性桿菌及霉菌相對增殖，導致原有菌群正常生態(tài)組合發(fā)生改變，引起菌群失調(diào)[11]。

大量研究表明，中藥治療肺病對調(diào)節(jié)腸道微生物多樣性有一定影響，如理肺湯可以調(diào)整慢性阻塞性肺疾病大鼠的腸道菌群結(jié)構，使其趨向正常菌群結(jié)構[12]。痰熱清注射液對COPD患者腸道微生物多樣性的影響國內(nèi)外尚未見報道。

從聯(lián)合用藥組患者腸道微生物豐度看，Ruminococcaceae(14.11%，瘤胃菌)、Lachnospiraceae(12.77%，毛螺旋菌)豐度排列靠前，目前針對該菌群研究尚少，但有可能對慢阻肺急性加重期患者病情改善有意義，還需進一步的研究證明。

本研究表明，聯(lián)合用藥組在治療后，g__Enterobacter(腸桿菌屬)、g__Eubacterium(真菌屬)和g__Eggerthella(放線菌屬)3種菌屬豐度明顯多于對照組，上述3種腸道菌屬在COPD發(fā)病中的作用未見臨床報道，其關聯(lián)尚需進一步的研究。

本研究為初步的觀察性研究，樣本量比較少，其結(jié)論尚不能全面反映COPD患者腸道微生物的情況及干預手段的效應，急需進一步的加強研究。