健脾益氣方對HIV/AIDS患者病毒載量與IL-2、IL-13、IFN-γ變化影響及相關性分析*

李 杰，李 強，桑 鋒，劉 真，王丹妮，徐立然

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，鄭州 450000)

HIV病毒侵入人體后主要破壞CD4+T淋巴細胞，導致HIV/AIDS患者細胞免疫功能降低,失去對外界抗原的抵抗力，從而誘發(fā)感染、皮疹及惡性腫瘤等，最后可導致死亡。健脾益氣方由人參、黃芪、炒白術等藥物組成，具有健脾益氣、養(yǎng)血解毒之功效。以健脾益氣為基礎的益艾康膠囊2004年被國家納入5省中醫(yī)藥治療艾滋病重點藥物，經過10余年的臨床應用及初步研究證實，益艾康膠囊能夠改善HIV/AIDS患者臨床癥狀，提高患者生存質量，降低病死率[1-2]。研究表明，細胞因子IL-2、IL-13、IFN-γ對免疫功能具有調節(jié)作用，提高CD4+T細胞增殖水平及免疫細胞抗HIV感染活性，進而對HIV病毒復制產生一定影響。探討HIV/AIDS患者病毒載量(簡稱VL)和細胞因子治療前后變化差異及其相關性，對研究健脾益氣方在HIV治療中的作用機制有重要意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及入選標準

艾滋病診斷參照《艾滋病診療指南》(2015版)[3]。納入標準：符合HIV/AIDS診斷標準者；年齡在18～60歲之間；自愿參與本次試驗并簽署知情同意書。排除標準：合并其他感染性疾病，如乙肝、梅毒、結核等；合并嚴重自身免疫性疾病、腫瘤及神經系統(tǒng)損害者；患有嚴重心、腦血管疾病，嚴重肝、腎及造血系統(tǒng)疾病者；過敏體質、孕婦或哺乳期及精神病者。

1.2 方法

1.2.1 一般人口學信息 研究對象采集信息包括年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、職業(yè)及可能感染途徑等。

1.2.2 樣本收集與分組 結合納入及排除標準，以本實驗室保存樣本為基礎，選擇河南省某AIDS高發(fā)地區(qū)28例HIV/AIDS患者為研究對象，收集患者治療1年前后樣本并分離血漿保存?zhèn)溆?。按血漿病毒載量水平將樣本分成4組。Ⅰ組：未檢測到HIV RNA(VL=0)；Ⅱ組：低于檢測下限(VL=20copies/ml)；Ⅲ組：201000 copies/ml。

1.2.3 血漿病毒載量檢測 取1 ml血漿加入S-tube管中，采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自動病毒載量儀檢測血漿病毒載量，試劑盒版本為HIV-1 Test, v2.0。檢測方法為Real-time PCR(探針法)定量檢測血漿中HIV RNA，擴增的靶核酸位于 HIV gag 區(qū)。試劑為內標法設有陰性質控品、弱陽性質控品和強陽性質控品各1個，檢測線性范圍20-10×107RNA copies/mL。

1.2.4 IL-2、IL-13、IFN-γ細胞因子檢測 樣品與標準品準備：取出-80 ℃保存樣品冰上融化，取25 μL血漿樣品用Sample Diluent 4倍稀釋，取50 μL上機備用； 將標準品用500 μL Standard Diluent稀釋，并按要求進行4倍比稀釋，冰浴30 min后使用。微珠、檢測抗體和Streptavidin-PE熒光色素準備：微珠稀釋前漩渦混合30 s冰浴，避光保存直至使用。以每孔50 μL計算，用Assay Buffer將微珠(10×)稀釋為1×；以每孔25 μL計算，用Detection Antibody Diluent將檢測抗體(10×)稀釋為1×；以每孔50 μL計算，用Assay Diluent將Streptavidin-PE稀釋100倍，10 min使用完畢。實驗操作流程：將標準品、樣品室溫平衡20 min以上；漩渦混合稀釋好的微珠15～20 s，每孔加入50 μL；將孔板置于真空泵上洗滌2次，按照板子設計加入標準品和樣品，每孔50 μL避光， 850-900RPM搖床避光孵育1 h；洗板3次，每孔加入檢測抗體25 μL，避光孵育30 min；洗板3次，每孔加入Streptavidin-PE 50 μL，避光孵育10 min；洗板3次，每孔加入125 μL Bio-Plex Assay Buffer重懸微珠，振蕩30 s，上機讀板檢測；實驗儀器采用Bio-Rad公司Bio-Plex 200高通量細胞因子檢測系統(tǒng)，使用Low PMT設置進行讀板獲取數(shù)據(jù)，檢測結果單位為pg/ml。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般人口學特征

表1顯示，28例HIV/AIDS患者的人口學特征。

表1 28例HIV/AIDS患者基本信息分布[例(%)]

2.2 治療前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13、IFN-γ水平比較

表2顯示，健脾益氣方治療1年前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13、IFN-γ檢測結果顯示，病毒載量在治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但IL-2、IL-13、IFN-γ治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即健脾益氣方治療1年后血漿IL-2、IL-13與IFN-γ水平比較治療前均有所升高。

2.3 不同病毒載量水平組間IL-2、IL-13、IFN-γ水平比較

表3顯示，治療前后IL-2、IL-13與IFN-γ組間比較顯示，治療前后不同病毒載量水平組間IL-2和IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，IL-13水平在治療前后組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IL-132組間比較結果顯示，治療前Ⅰ組與Ⅲ組、Ⅰ組與Ⅳ組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后Ⅱ組與Ⅲ組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即隨著病毒載量水平增加血漿IL-13水平有所增加。

表2 健脾益氣方治療前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13與IFN-γ水平變化比較

表3 不同病毒載量水平組間IL-2、IL-13、IFN-γ水平變化

注：與Ⅰ組比較:aP<0.05；與Ⅱ組比較:bP<0.05；與Ⅲ組比較:cP<0.05；與Ⅳ組比較:dP<0.05

2.4 治療前后病毒載量與IL-13相關性分析

表4顯示，病毒載量與IL-13在治療前后均呈現(xiàn)中度正相關關系(P<0.05)。

表4 治療前后病毒載量與IL-13的關系

3 討論

IL-2與IFN-γ主要由Ⅰ型輔助性T細胞(Th1)產生具有誘導活化的T細胞和B細胞增殖，增強NK細胞的細胞毒性作用，抑制病毒復制的功能，在抗病毒、抗細菌感染和抗腫瘤等疾病的治療中已得到廣泛應用[4]。IL-13主要由Ⅱ型輔助性T細胞(Th1)產生，它能有效抑制單核細胞釋放炎性細胞因子，誘導B細胞增殖和分化，促進IgE合成，促進內皮細胞上表達某些黏附分子及抑制HIV-1病毒復制[5]。據(jù)報道，在HIV感染早期，隨著HIV病程發(fā)展由Th1細胞分泌的IL-2和IFN-γ水平逐漸下降，同時Th2細胞分泌的細胞因子水平逐漸升高，因此細胞因子水平的變化與HIV疾病進展有很大相關性[6]。

T細胞亞群檢測和血漿病毒載量水平變化一直以來都是反映疾病進展的“金標準”，但在健脾益氣方治療前后病毒載量無明顯變化，說明該中藥治療法在直接降低血漿HIV病毒載量水平方面與HAART療法比較并無優(yōu)勢[7]。相反，IL-2、IL-13、IFN-γ細胞因子水平在治療后有明顯升高，這可能成為健脾益氣方調節(jié)機體免疫功能狀態(tài)、刺激免疫功能重建的作用機制[8-9]。不同病毒載量水平組間3種細胞因子差異表現(xiàn)不盡相同，其中IL-2與IFN-γ治療前后變化不明顯，而IL-13水平在治療前后組間有明顯差異，并與病毒載量的相關性較好，這與文獻報道中IL-13能顯著降低HIV病毒的感染性，影響病毒DNA合成相一致[10]。

總之， IL-2、IL-13與IFN-γ細胞因子檢測在評價健脾益氣方治療HIV/AIDS患者臨床療效方面有重要意義，但是將其作為免疫監(jiān)測的工具，為臨床治療提供客觀依據(jù)還有待進一步的研究。