肝郁脾虛胰島素抵抗肥胖大鼠模型的建立與評價*

張 旭，周 珊，陳慧臻，高 陽，朱宇溪，陳 秋

(成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610072)

肝郁脾虛證又稱肝脾不和證，是中醫(yī)常見的臟腑病證之一，其形成多與現(xiàn)代抑郁、焦慮、悲痛等負(fù)面情緒心理應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)[1]。肝主疏泄，調(diào)暢氣機，協(xié)助脾胃升降并輸送膽汁于腸道，促進(jìn)脾胃對飲食物的運化、輸布。肝病則疏泄失職，中焦氣機阻滯，升降失司，脾氣不升則清氣在下生飧泄，出現(xiàn)腸鳴、腹瀉等癥狀，胃氣不降則濁氣在上生嗔脹。中焦氣郁，郁則氣消，脾虛運化失常，氣血生化無源，則出現(xiàn)納差、消瘦等癥狀；患病日久痰濕內(nèi)生，郁而化熱，致脾弱胃強。胃火熾盛，納食亢進(jìn)，負(fù)荷加重，然脾虛運化無力又生痰濕致人肥胖。但是目前國內(nèi)建立的肝郁脾虛證模型普遍存在造模時間短，只考察短期內(nèi)肝郁脾虛引起的體質(zhì)量下降，而未對長時間肝郁脾虛引起的食欲亢進(jìn)、肥胖和代謝紊亂進(jìn)行評估[2-3]。因此本實驗?zāi)M現(xiàn)代人情志不遂致病的病因病機，在以往研究的基礎(chǔ)上延長了肝郁脾虛證造模的時間，建立了長時間的肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型，并從體質(zhì)量、血糖、血脂水平、內(nèi)臟指數(shù)、激素水平和胰島素抵抗等方面進(jìn)行了綜合考察和評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供(批號SCXK2015-030)，自由攝食進(jìn)水，室溫18～25 ℃。

1.2 實驗儀器

ISP-21半自動生化分析儀(荷蘭)；BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)；TGL-16G臺式離心機(上海安亭儀器廠)；高速低溫離心機(德國HERAEUS)；SN-682放射免疫γ計數(shù)器(中國科學(xué)院上海原子核研究所日環(huán)儀器廠)；八臂迷宮測試系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 試劑

血糖檢測試劑盒(批號分別為1704121、1705031、1705041)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒(批號1705041)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(批號1705031)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(批號1705031)均為四川邁克科技責(zé)任有限公司產(chǎn)品；125I-胰島素、125I-胰高血糖素、125I-皮質(zhì)酮放射免疫分析試劑盒為北京市北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品(批號20170620)，其他試劑均為分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模篩選實驗方法 將40只雌性Wistar大鼠分為正常對照組、慢性束縛組、夾尾組和慢性束縛+夾尾組各10只。慢性束縛法造模[2]：即將大鼠放入自制的有機玻璃制成的圓筒狀結(jié)構(gòu)，令其身軀和四肢不能自由活動，每日連續(xù)束縛3 h(8∶00-11∶00am)；夾尾法造模[4]：每日用塑料夾夾尾1 h(3∶00-4∶00 pm)，以刺激大鼠使其感覺不適，從而嘗試轉(zhuǎn)頭咬掉塑料夾，但轉(zhuǎn)頭咬掉塑料夾的努力往往徒勞無功，如若塑料夾被咬掉立即重新夾上，這樣不僅可以讓每只大鼠受到的刺激基本相同，刺激時間較長并持續(xù)不斷，又讓其郁怒不已，更好地收到“怒傷肝，久則郁”的效果；慢性束縛加夾尾法造模：每日連續(xù)束縛3 h(8∶00-11∶00am)，當(dāng)日下午再將大鼠用塑料夾夾尾1 h(3∶00-4∶00 pm)。連續(xù)造模8周，期間正常飲食，每2周測量攝食量、體質(zhì)量，并于第8周(實驗第56天)對其肝郁脾虛一般情況和行為學(xué)進(jìn)行評估。

1.4.2 長期肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型評價方法 將20只雌性Wistar大鼠分為正常對照組和模型組各10只。模型組按照上述篩選成功的造模方法即慢性束縛+夾尾法進(jìn)行，造模時間連續(xù)8周。造模期間正常飲食，每隔2周連續(xù)測量體質(zhì)量并在眼球后靜脈叢采血測血糖、血脂。并于第8周(實驗第56天)8∶00 pm開始各組大鼠禁食，次日8∶00am進(jìn)行胰島素鉗夾實驗。實驗結(jié)束時處死所有大鼠并收集血液，0.1 mol/L EDTA抗凝，立即離心并分離血漿用于測定或保存于-20 ℃。同時取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺測內(nèi)臟指數(shù)(內(nèi)臟指數(shù)=內(nèi)臟重/體質(zhì)量×1000)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況觀察 肝郁脾虛證采用動物外觀及行為積分量表[3]的形式作為判斷一般情況的標(biāo)準(zhǔn)，包括活動狀態(tài)、皮膚毛發(fā)變化、對外界刺激的反應(yīng)、大便性狀、掙扎時的表現(xiàn)、精神狀態(tài)，根據(jù)上述表現(xiàn)明顯記3分，介于明顯與輕微間記2分，輕微記1分，沒有記0分。

1.5.2 行為學(xué)指標(biāo)測試 用高架十字迷宮實驗[5]測試大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)比(OE%)、開放臂停留時間比(OT%)以及開放臂和封閉臂總的進(jìn)入次數(shù)(OE+CE)。同時，用強迫游泳實驗[6]記錄大鼠在5 min內(nèi)靜止的時間。

1.5.3 血糖、血脂的測定 具體操作參見試劑盒說明書，結(jié)果以mmol/L表示。

1.5.4 血漿激素含量測定 用放射免疫法進(jìn)行測定，具體操作參見試劑盒說明書。檢測結(jié)果胰島素以μIU/mL表示，胰高血糖素以pg/mL表示，皮質(zhì)酮以μg/mL表示。

1.5.5 胰島素抵抗的判定 用高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗[7-8]評價胰島素敏感性。這一技術(shù)由De Fronoz于1979年創(chuàng)立，是目前世界公認(rèn)的評價胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)。鉗夾實驗結(jié)束后采血常規(guī)制備血清，處死動物迅速取出肝臟、腎臟、脾臟、胸腺并稱重。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 長期肝郁脾虛肥胖大鼠模型方法篩選

2.1.1 各組大鼠一般情況和行為學(xué)指標(biāo)的變化 表1顯示，與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠一般情況評分在第8周時均顯著下降(P<0.01)，大鼠既表現(xiàn)有情緒焦慮或精神抑郁等肝郁之象，也表現(xiàn)出大便溏薄、活動遲滯等脾虛之象，說明3組大鼠肝郁脾虛癥狀都非常明顯，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)比(OE%)、開放臂停留時間比(OT%)以及開放臂和封閉臂總的進(jìn)入次數(shù)(OE+CE)均顯著下降，同時3組大鼠強迫游泳實驗5 min內(nèi)的靜止時間也顯著高于正常對照組。

表1 各組大鼠一般情況和行為學(xué)指標(biāo)變化比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.1.2 各組大鼠日均攝食量的變化 表2顯示，與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠在第2周、第4周攝食量均減少，但在4周后3組大鼠的攝食量均有回升趨勢，尤其是束縛+夾尾組大鼠在第6周和第8周的攝食量與正常對照組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠日均攝食量變化比較(g)

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.1.3 各組大鼠體質(zhì)量變化 表3顯示，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠在前4周內(nèi)體質(zhì)量均下降，在第4周時與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在4周后，3組大鼠體質(zhì)量有回升趨勢，但在第6周時與正常對照組比較無明顯差異。而束縛+夾尾組大鼠6周后體質(zhì)量持續(xù)增長，在第8周時與正常對照組比較顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g)

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 長期肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型方法評價

2.2.1 2組大鼠體質(zhì)量、血糖和血脂變化 表4顯示，模型組大鼠體質(zhì)量在前4周內(nèi)出現(xiàn)明顯下降，在第4周時與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在4周后體質(zhì)量逐漸增加，第6周時與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第8周體質(zhì)量超過正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，模型組大鼠的血糖和總膽固醇(TC)在4周后有增高趨勢，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外， 模型組大鼠的甘油三酯(TG)在4周后明顯增加，而高密度脂蛋白(HDL)則明顯降低，在第6周和第8周時與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 2組大鼠體質(zhì)量、血糖和血脂變化比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 2組大鼠內(nèi)臟指數(shù)、血漿激素和葡萄糖輸注率的變化 表5顯示，模型組大鼠的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)增加，而脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。另外模型組大鼠的血漿胰島素、胰高血糖素和皮質(zhì)酮水平均增加，其中胰島素和皮質(zhì)酮含量與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時模型組大鼠的葡萄糖輸注率下降，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表5 2組大鼠內(nèi)臟指數(shù)、血漿激素和葡萄糖輸注率變化比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肝郁脾虛證的基本病機為肝失疏泄，脾失健運，主要表現(xiàn)為精神抑郁、情緒不寧、胸脅脹悶或易怒善哭、脘悶噯氣、不思飲食、大便不調(diào)為特征的一類臨床病證。如唐容川《血證論》所云：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化。設(shè)肝之清陽不升，則不能疏泄水谷，滲泄中滿之證，在所不免?！睆默F(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點來看，長時間的焦慮、抑郁會引發(fā)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)功能的改變，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖和代謝紊亂[9]。我們第一步的工作就是篩選出長時間肝郁脾虛致大鼠肥胖模型的方法，然后再對篩選出的模型進(jìn)行全面評價。

從初篩實驗中我們采用的3種方法來看，無論是慢性束縛組、夾尾組還是慢性束縛加夾尾組，3組大鼠在連續(xù)造模8周后其肝郁脾虛癥狀均較明顯，并在前4周內(nèi)3組大鼠的攝食量和體質(zhì)量均出現(xiàn)明顯的下降，這與文獻(xiàn)的報道較一致[2-3]。但慢性束縛加夾尾組大鼠的攝食量和體質(zhì)量在4周后持續(xù)增加，增加幅度大于單純束縛和單純夾尾組。故根據(jù)對上述實驗結(jié)果分析我們認(rèn)為，初篩的3種方法中，慢性束縛加夾尾法是建立長期肝郁脾虛致肥胖大鼠模型的較佳方法。

采用慢性束縛加夾尾的方法進(jìn)一步重復(fù)8周的實驗結(jié)果看，該方法造模的大鼠在實驗后期體質(zhì)量的增長依然保持穩(wěn)定，甘油三酯(TG)顯著增高，高密度脂蛋白(HDL)顯著下降。除此之外，肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和血漿皮質(zhì)酮水平在第8周時也顯著增高。皮質(zhì)酮是腎上腺皮質(zhì)分泌的主要激素，在慢性應(yīng)激狀態(tài)下升高的皮質(zhì)酮具有升高血糖、降低胰島素敏感性、促進(jìn)脂肪動員和導(dǎo)致向心性肥胖的作用[10]。在這種情況下，機體對糖的利用減少，而脂肪的分解代謝增強，產(chǎn)生大量的游離脂肪酸(FFA)釋放入血，并進(jìn)入其他組織重新合成脂肪導(dǎo)致脂質(zhì)異位沉積。而進(jìn)入肝臟的FFA增多可使TG和VLDL增加，加重血脂異常并導(dǎo)致肝臟脂肪變性和質(zhì)量增加，出現(xiàn)中心性肥胖[11]。同時這些過度堆積的脂肪又是機體出現(xiàn)胰島素抵抗的主要原因，其機制主要與脂肪細(xì)胞來源的激素，如瘦素、抵抗素的增多以及脂聯(lián)素的降低有關(guān)，這些激素分泌的變化不但影響脂肪的存儲與釋放，還會降低靶組織對胰島素的敏感性[12]。因此，脂肪過度沉積與肥胖往往與胰島素抵抗互為因果。為克服胰島素抵抗，機體往往代償性地分泌過多胰島素引起高胰島素血癥，后者可能進(jìn)一步加重組織的胰島素抵抗程度[11]。臨床可通過高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗檢測靶組織對胰島素的敏感性。我們通過這一實驗也發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在肥胖、肝臟增大的同時也出現(xiàn)了一定程度的胰島素抵抗。

另外，情緒刺激可通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)(NIM)引起免疫功能異常。肝郁脾虛證是中醫(yī)肝郁和脾虛的復(fù)合證，也涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)功能的改變，提示肝郁脾虛證的現(xiàn)代內(nèi)涵與免疫功能異常有關(guān)[13]。而胸腺和脾臟分別是體內(nèi)中樞和外周的主要免疫器官，在維持機體正常免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用。本次實驗觀察到，慢性束縛加夾尾法導(dǎo)致肝郁脾虛大鼠胸腺和脾臟指數(shù)均呈現(xiàn)顯著下降，且皮質(zhì)酮在后期也明顯升高。皮質(zhì)酮不僅可以提高機體的應(yīng)激能力，而且還有降低免疫力的作用[10]。因此，大鼠在束縛加夾尾導(dǎo)致肝郁脾虛的同時脾臟和胸腺指數(shù)均下降，其中一個原因是與長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)有關(guān)。

總之，我們用長時間慢性束縛加夾尾法成功誘導(dǎo)肝郁脾虛大鼠肥胖和胰島素抵抗模型。該模型具有成模后肝郁脾虛證癥狀較明顯，體質(zhì)量在早期短時間內(nèi)降低后出現(xiàn)增高且維持穩(wěn)定，血脂代謝和激素異常也與大多人類肥胖癥相似，同時兼有免疫抑制現(xiàn)象等優(yōu)點，且該造模方法簡單易操作，有利于后續(xù)藥理學(xué)實驗進(jìn)行。