PK-15細胞中與CSFV感染相關的microRNAs篩選及 miR-214的功能研究

鄧少鋒，葉佐東，范雙旗，陳金頂，張靜遠，朱夢嬌，趙明秋

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PK-15細胞中與CSFV感染相關的microRNAs篩選及 miR-214的功能研究

鄧少鋒，葉佐東，范雙旗，陳金頂，張靜遠，朱夢嬌，趙明秋

（華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642）

【目的】利用制作的豬的miRNA表達譜芯片篩選豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染PK-15細胞后表達有差異的miRNA，并進一步探討其中表達差異較明顯的miRNA的作用和功能，從miRNA的角度探究CSFV的致病機制，為豬瘟（classical swine fever，CSF）的防控提供新依據(jù)。【方法】為了研究CSFV感染PK-15細胞后miRNA表達的變化情況，根據(jù)miRBase version 19.0數(shù)據(jù)庫中326條豬的miRNA合成探針，采用原位合成技術制作表達譜芯片，篩選得到CSFV感染PK-15細胞后表達有差異的miRNA。挑選CSFV感染PK-15細胞后表達差異最明顯的miR-214作為進一步研究對象，研究miR-214在CSFV感染過程中的功能和作用。CSFV感染PK-15細胞后，用熒光定量PCR檢測miR-214的mRNA表達水平。為了進一步研究miR-214對CSFV感染的影響，合成miR-214模擬物及抑制物，并分別轉染PK-15細胞，轉染后24 h感染CSFV，感染后48h用熒光定量PCR檢測CSFV的基因拷貝數(shù)，用間接免疫熒光方法檢測CSFV的病毒滴度。為了進一步探究miR-214參與調(diào)控CSFV復制的機制，通過生物信息學軟件預測miR-214參與調(diào)控CSFV復制的靶蛋白，并用熒光素酶報告基因系統(tǒng)進一步確證miR-214能夠靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1 相關的死亡區(qū)域蛋白（TNF Receptor-Associated Death Domain，TRADD），因此猜測miR-214通過影響靶蛋白TRADD的表達水平從而影響PK-15細胞凋亡，將miR-214模擬物及抑制物分別轉染PK-15細胞，轉染后24 h感染CSFV，同步設立不感染CSFV的細胞對照，感染后48 h用熒光定量PCR和Western blot分別檢測TRADD的mRNA和蛋白表達量的變化，同時用流式細胞術檢測miR-214對CSFV感染的PK-15細胞凋亡的影響?！窘Y果】CSFV感染PK-15細胞后，通過表達譜芯片技術篩選得到69條表達有差異的miRNA，其中miR-214表達量上調(diào)且差異最明顯。qRT-PCR結果顯示，CSFV感染PK-15細胞后miR-214的mRNA表達量上調(diào)，驗證了表達譜芯片的結果。將miR-214模擬物轉染PK-15細胞后再感染CSFV， CSFV的基因拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著下降；轉染miR-214抑制物后再感染CSFV，CSFV的基因拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著上升，表明miR-214促進了CSFV的復制。為了進一步探究miR-214促進CSFV復制的機制，用生物信息學軟件預測TRADD為miR-214的靶蛋白，熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證了miR-214能夠靶向作用于TRADD。轉染miR-214模擬物后，PK-15細胞中TRADD的mRNA和蛋白表達量均顯著上升，而轉染miR-214抑制物后，PK-15細胞中TRADD的mRNA和蛋白表達量均顯著下降，表明miR-214抑制TRADD的表達。通過流式細胞術，驗證了CSFV感染PK-15抑制細胞凋亡，miR-214抑制CSFV感染的PK-15細胞凋亡?！窘Y論】CSFV感染PK-15后，上調(diào)細胞內(nèi)miR-214的表達。miR-214能通過靶向抑制TRADD蛋白的表達，從而抑制PK-15細胞凋亡，促進CSFV在細胞內(nèi)的復制。

豬瘟病毒；miRNA；復制；TRADD；凋亡

0 引言

【研究意義】豬瘟（classical swine fever, CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）引起的豬的一種重大烈性傳染性疾病[1]，被世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）列為法定報告動物傳染病之一[2]，嚴重危害著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成重大經(jīng)濟損失。CSFV的致病機制十分復雜，因此，從不同角度深入研究其致病過程有利于促進對CSFV致病機制的認識。microRNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小分子RNA，通過與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域互補匹配抑制該mRNA分子的翻譯，從而對靶蛋白表達進行調(diào)控[3]。miRNA在病毒致病性以及病毒與宿主的相互作用方面發(fā)揮重要作用，但是對CSFV相關的miRNA研究較少。本研究通過生物信息學等試驗方法篩選出可能與豬瘟病毒相關的miRNA，并對其進行功能研究，從宿主細胞的角度研究豬瘟病毒與細胞之間相互作用的關系，為豬瘟病毒的致病機理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】研究證實miRNA參與許多重要生物學過程，包括調(diào)控信號通路[4-6]、促進機體發(fā)育[7]、誘導細胞凋亡[8-10]、參與免疫反應[11-13]以及在病毒感染中發(fā)揮作用。研究表明，有些miRNA能夠直接以病毒基因組為靶位，調(diào)節(jié)病毒的復制[14-15]。有些miRNA能介導宿主的抗病毒活性[16-17]。目前對于CSFV相關的miRNA研究較少，如miRNA-let-7c可下調(diào)CSFV的RNA復制水平[18]。作為與CSFV同屬黃病毒科的HCV的相關miRNA的研究已經(jīng)十分深入[14, 19-20]，對研究CSFV相關miRNA的作用有很大指導意義?！颈狙芯壳腥朦c】miRNA在病毒感染中發(fā)揮重要作用，但目前對于CSFV相關的miRNA研究較少，而作為與CSFV同屬黃病毒科的HCV的研究已十分成熟，對研究CSFV相關miRNA的作用有很大指導意義?！緮M解決的關鍵問題】通過生物信息學和試驗方法篩選出可能與CSFV感染相關的miRNA及其功能研究，從宿主細胞的角度來研究CSFV與細胞相互作用的關系，為研究其致病機理提供有價值的科學資料。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2016年5月在華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院完成。

1.1 試驗材料

豬源腎臟細胞（PK-15）、CSFV石門株和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室保存。pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院王翀教授惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒接種和滴度測定 PK-15細胞傳代于培養(yǎng)瓶中生長到80%—90%時，用PBS洗滌細胞2次，加入CSFV病毒液，置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育4—6 h后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞2次，加入細胞維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后收獲病毒液，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用無血清無抗生素的DMEM將上述所獲得的CSFV病毒液分別做10倍連續(xù)梯度稀釋至10-10，再分別將每個梯度的病毒液按0.1 mL/孔接種4孔細胞，同時設空白細胞對照。接種CSFV后繼續(xù)培養(yǎng)5 d，取出細胞培養(yǎng)板進行間接免疫熒光檢測，并計算CSFV感染滴度。

1.2.2 細胞總RNA的提取與檢測 棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，加1 mL的胰酶消化并收集細胞至1.5 mL離心管中，參考Omega公司的總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，再經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的總RNA的完整性，并用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。

1.2.3 制作miRNA表達譜芯片 miRNA表達譜芯片試驗是由廣州銳博公司完成。根據(jù)miRBase version 19.0數(shù)據(jù)庫中326條豬miRNA合成探針，采用原位合成技術制作表達譜芯片。miRNA表達譜芯片制作完成后進行掃描。

1.2.4 熒光定量PCR檢測基因的表達 分別采用相應的反應體系和條件，根據(jù)PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit說明書和PrimeScript? RT Master Mix說明書進行反轉錄反應合成miRNA cDNA和病毒基因或蛋白基因cDNA。然后根據(jù)SYBR? Premix Ex Taq? II說明書進行qRT-PCR檢測基因的表達。

1.2.5 生物信息學預測miRNA的靶標蛋白 根據(jù)miRNA表達譜芯片篩選出來CSFV感染PK-15后表達變化的miRNA，用Target Scan、RNA22、Pictar等生物信息學軟件預測miRNA的靶蛋白。

1.2.6 重組質粒的構建 提取PK-15細胞總RNA并反轉錄為cDNA作為模板，以上游引物：5′CCGCTCG AGGCGGCCGCCTGAGTACCAGAGAAAGAGG3′，下游引物：5′TGCTCTAGA TCAGAGTACCAT ACTG AGTG3′，擴增TRADD 3′UTR基因。膠回收PCR產(chǎn)物和表達載體，以I和I進行雙酶切。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。按T4 DNA連接酶說明書進行目的片段與載體質粒的連接，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行菌落PCR，同時送測序公司測序。選取菌落PCR和測序正確的菌落，按照Omega無內(nèi)毒素質粒抽提試劑盒說明書進行質粒抽提。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測試驗 將PK-15細胞接種至24孔培養(yǎng)板，待細胞生長密度至80%左右時，按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行轉染。將合成的miRNA 模擬物、模擬物對照、miRNA 抑制物、抑制物對照分別與pmirGLO-TRADD 3′UTR質粒共轉染，以單獨轉染pmirGLO-TRADD 3′UTR質粒重組質粒為對照。轉染24 h后，用GloMax生物化學發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。

1.2.8 免疫印跡試驗（Western blot） 裂解細胞提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白樣品進行定量。蛋白樣品與含有5%的β-巰基乙醇上樣緩沖液充分混合后，放入95℃水浴鍋中加熱5 min，進行蛋白變性。變性后的蛋白80 V電泳2 h，采用濕法轉膜（200 mA、1 h）將蛋白轉印到PVDF膜上，用含5%吐溫的PBS（PBST）室溫漂洗轉印后的PVDF膜3次，每次10 min，加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉液37℃搖床搖動封閉1 h。用PBST洗滌3次后4℃過夜孵育一抗，次日取出孵育后的PVDF膜用PBST漂洗3次，37℃條件下孵育HRP標記的熒光二抗1 h，漂洗3次后，掃描PVDF膜。

1.2.9 流式細胞術 按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書方法，檢測細胞凋亡率。用PBS洗滌細胞2次，加入適量胰酶消化后，棄去胰酶，用1 mL細胞培養(yǎng)液吹打混勻細胞，轉移到離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取5—10萬重懸的細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Annexin V-FITC結合液和10 μL碘化丙錠（PI）染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10—20 min，隨后置于冰浴中。進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有實驗都至少重復3次，獲得的數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，利用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學作圖和差異顯著性分析。統(tǒng)計學分析采用檢驗（＜0.05；＜0. 01；＜0.001），當＜0.05時認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 PK-15細胞中與CSFV感染相關的miRNA的初步篩選

為了檢測CSFV體外感染PK-15細胞后miRNA表達的變化，用CSFV石門株感染PK-15，24 h后進行miRNA表達譜芯片試驗。結果表明，CSFV感染PK-15細胞后，誘導細胞miRNA差異表達。與未感染CSFV的對照組相比，CSFV感染PK-15細胞共引起69條miRNAs表達變化，其中包括39條miRNAs表達量上調(diào)，30條miRNAs表達量下調(diào)（表1、表2）。這表明CSFV感染PK-15細胞后，宿主細胞miRNA表達發(fā)生變化。

2.2 CSFV上調(diào)miR-214的表達水平

miRNA表達譜芯片的結果顯示，在上調(diào)的39條miRNAs中，miR-214表達差異最明顯，故選取miR-214作為研究對象，研究其在CSFV體外感染中的功能與作用。為了驗證基因芯片數(shù)據(jù)結果，采用qRT-PCR方法驗證miR-214在CSFV感染的PK-15細胞中的表達情況。結果顯示，CSFV感染PK-15細胞后，隨著時間推移，miR-214表達水平逐漸升高（圖1），與表達譜芯片結果一致，表明CSFV感染促進了miR-214的表達。

2.3 miR-214模擬物與抑制劑效果檢測

根據(jù)miRBase下載miR-214的序列并合成其模擬物及對應的抑制劑。將miR-214模擬物和抑制劑分別轉染PK-15，24 h后提取細胞總RNA，qRT-PCR檢測細胞內(nèi)miR-214的表達量。結果顯示，miR-214模擬物轉染能夠極顯著提高細胞內(nèi)miR-214的表達水平（圖2-A），抑制劑則相應的顯著抑制miR-214的表達水平（圖2-B）。表明合成的miR-214模擬物及抑制劑可以進行后續(xù)試驗。

圖1 CSFV感染PK-15細胞后miR-214的表達水平

2.4 miR-214促進CSFV復制

為了確定miR-214對CSFV復制的影響，將miR-214 模擬物和抑制劑分別轉染PK-15細胞，轉染后24 h，以MOI=0.1接種CSFV石門株，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取細胞總RNA，用qRT-PCR方法檢測CSFV NS5B mRNA表達水平。收集細胞培養(yǎng)液上清，間接免疫熒光（IFA）檢測病毒滴度。結果表明，miR-214模擬物能夠顯著促進CSFV的復制及病毒滴度（圖3-A），而miR-214抑制劑顯著抑制了CSFV的復制及病毒滴度（圖3-B），表明miR-214促進了CSFV RNA復制。

2.5 熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-214的靶蛋白TRADD

為了進一步確認miR-214能夠靶向作用于TRADD，將TRADD的3′UTR區(qū)域構建入熒光素酶報告基因表達載體。分別共轉染重組質粒與miR-214模擬物和miR-214抑制劑，24 h后檢測熒光素酶活性。結果顯示，轉染miR-214 模擬物能夠顯著下調(diào)熒光素酶報告基因的表達（圖4-A），而轉染miR-214抑制劑能夠顯著上調(diào)熒光素酶報告基因的表達（圖4-B），表明miR-214能夠靶向作用于TRADD的3′UTR，進一步證明了miR-214對TRADD的靶向作用。

表1 CSFV感染PK-15細胞后表達量上調(diào)的miRNA

表2 CSFV感染PK-15細胞后表達下調(diào)的miRNA

2.6 生物信息學軟件預測miR-214的靶蛋白

通過TargetScan、RNA22、Pictar等生物信息學軟件預測miRNA的靶蛋白，發(fā)現(xiàn)，TRADD的3′UTR區(qū)域存在miR-214潛在作用靶點（圖5）。

2.7 miR-214抑制TRADD的表達

通過上述試驗，證明了miR-214對TRADD的靶向作用。為了進一步探究miR-214對TRADD表達的影響，將miR-214 模擬物及其抑制劑轉染細胞，24 h后以MOI=0.1接種CSFV石門株，同步設立不感染組作為對照。 48 h后收集細胞提取總RNA，用qRT-PCR方法檢測潛在靶蛋白TRADD的mRNA表達水平，驗證miR-214對TRADD表達的影響。結果顯示，miR-214模擬物能夠顯著下調(diào)TRADD mRNA表達（圖6-A），而miR-214抑制劑則顯著上調(diào)TRADD mRNA表達（圖6-B）。同時裂解細胞提取總蛋白，用鼠源TRADD單抗和鼠源β-actin單抗進行Western blot，檢測TRADD的蛋白表達水平。結果顯示，miR-214模擬物抑制了TRADD的蛋白表達水平，而miR-214抑制劑則促進了TRADD的蛋白表達（圖7）。綜上試驗結果表明，miR-214能抑制TRADD的表達。

A. miR-214模擬物轉染細胞后miR-214的表達量；B. miR-214抑制劑轉染細胞后miR-214的表達量

A. miR-214對CSFV NS5B mRNA表達量的影響；B. miR-214對CSFV病毒滴度的影響

2.8 CSFV體外感染抑制PK-15細胞凋亡

有研究表明，CSFV在體外感染過程中通過抑制細胞凋亡實現(xiàn)持續(xù)感染[21]。在本研究中，首先驗證CSFV對細胞凋亡的影響。PK-15細胞在6孔板中培養(yǎng)生長至80%，接種CSFV（MOI=1），同步設立未感染為對照組，感染24 h后，收集細胞，用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示，與對照組相比，CSFV感染PK-15細胞后抑制了細胞的凋亡（圖8）。

2.9 miR-214抑制PK-15細胞凋亡

試驗證明CSFV感染PK-15細胞后抑制細胞凋亡，有研究表明，TRADD與腫瘤壞死因子受體相互作用，能誘導細胞凋亡[22-23]，而miR-214能抑制TRADD的表達。為了驗證在CSFV體外感染過程中，miR-214是否參與調(diào)控細胞凋亡，PK-15細胞轉染miR-214模擬物，用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示，miR-214模擬物能夠抑制細胞凋亡（圖9-A）。為了進一步驗證在CSFV感染過程中，miR-214對凋亡的影響，將miR-214 模擬物和抑制劑及其相應的陰性對照轉染PK-15細胞，轉染24 h后，以MOI=0.1接種CSFV石門株，48 h后用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示，在未感染CSFV的PK-15細胞中，轉染miR-214模擬物下調(diào)了細胞凋亡率，而轉染miR-214抑制劑能夠上調(diào)細胞凋亡率。同樣，在CSFV感染組中，得到一致的結果，即轉染miR-214模擬物能夠下調(diào)細胞凋亡率，而轉染miR-214抑制劑能夠上調(diào)細胞凋亡率（圖9-B、C）。由此推測，在CSFV感染過程中，miR-214可能參與抑制細胞凋亡。

圖4 miR-214對pmirGLO-TRADD 3′UTR熒光素酶活性的影響

圖中紅色標注部分為miR-214與TRADD的3′非翻譯區(qū)互補配對的堿基對

A.轉染miR-214 對TRADD mRNA表達的影響；B.轉染miR-214抑制物對TRADD mRNA表達的影響

A.轉染miR-214模擬物對TRADD 蛋白表達的影響；B.轉染miR-214抑制劑對TRADD 蛋白表達的影響；C和D分別為A和B光密度比值的統(tǒng)計學分析

A. PK-15細胞未感染CSFV的凋亡率；B. PK-15細胞感染CSFV的凋亡率；C.CSFV感染組與對照組凋亡率的統(tǒng)計學分析

A. miR-214對PK-15細胞凋亡的影響；B. miR-214對在CSFV感染條件下PK-15細胞凋亡的影響；C. miR-214抑制劑對在CSFV感染條件下PK-15細胞凋亡的影響

3 討論

miRNA是一類調(diào)節(jié)性非編碼RNA分子，廣泛存在于植物、動物以及動物病毒的基因組，主要參與基因轉錄后調(diào)控。近年來大量研究表明，細胞內(nèi)的miRNA在調(diào)控宿主細胞基因及病毒復制中發(fā)揮重要作用[20,24]，但是大部分研究都是基于人和小鼠等模式動物上，對豬源miRNA的研究較少。此外，對于HCV的miRNA的研究較為深入，為HCV致病機理研究方面提供了很多理論支持。展開對CSFV相關miRNA的研究，為揭示其致病機理開辟了新的方向，也為防控CSFV及尋找藥物靶位提供了新的策略。

本研究中，以PK-15細胞為研究對象，通過表達譜篩選出與CSFV密切相關的差異表達的細胞miRNA，為研究miRNA介導調(diào)控CSFV感染致病機制打下前期基礎。表達譜試驗共篩選出69條差異表達的miRNA，但是與未感染CSFV的細胞組相比，大部分miRNA表達變化差異不大，差異水平在1.5倍左右，最多達到4倍，與其他病毒的miRNA表達譜結果相比，變化差異不是非常明顯。推測其原因，可能跟病毒及種屬有關，也可能細胞miRNA表達量相對較高，導致病毒感染后表達雖然有變化，但是變化比例較小。如果聯(lián)合全基因組小RNA高通量測序，得到的差異結果可能更明顯。另外，也可能與CSFV病毒自身感染PK-15細胞的特性有關，miRNA的調(diào)控水平可能較微弱。

本試驗選擇miR-214為研究對象，因為在篩選CSFV上調(diào)的39條miRNA當中，miR-214的表達差異最大。此外，miR-214的靶蛋白TRADD對凋亡具有調(diào)節(jié)作用。前期的研究表明豬瘟病毒能夠抑制凋亡，達到持續(xù)感染的目的[21,25]。已經(jīng)有大量的研究報道m(xù)iR-214參與調(diào)控細胞凋亡，如miR-214能直接靶向于Bcl2l2，通過抑制Bcl2l2蛋白表達水平，從而誘導凋亡[26]；在鼻咽癌組織或細胞系中高表達miR-214，而抑制miR-214表達，能夠上調(diào)Bim蛋白的表達，從而促進細胞凋亡抑制癌細胞增殖[27]。因此推測，宿主miR-214在CSFV感染的PK-15細胞中參與調(diào)控細胞凋亡。

細胞凋亡是細胞Ⅰ型死亡程序，細胞凋亡啟動細胞程序性死亡后不利于病毒在細胞內(nèi)的存活和持續(xù)性感染[28]。有研究表明，CSFV感染細胞后，可以通過抑制細胞凋亡從而促進病毒的復制[21]。通過生物信息學手段預測miR-214的靶蛋白中，發(fā)現(xiàn)TRADD存在miR-214結合位點，推測可能是miR-214的靶蛋白之一。死亡受體介導的細胞凋亡包括FASL- FAS、TRAIL-DR4以及TNFα-TNFR1途徑[29-30]，TRADD作為TNFα-TNFR1途徑中一個接頭分子，對下游凋亡信號激活及分子招募至關重要。因此本試驗對TNFα-TNFR1介導的凋亡進行探討，結果證明在CSFV感染中高表達miR-214能夠一定程度上抑制TRADD表達，抑制PK-15細胞凋亡。表明CSFV體外感染中抑制細胞凋亡的機制可能與CSFV上調(diào)的miR-214有關。

綜上所述，本研究篩選出CSFV感染誘導差異表達的miRNA，為以后研究miRNA介導調(diào)控CSFV感染和從miRNA方面揭示CSFV致病機理奠定了基礎。此外，細胞凋亡作為宿主抗病毒感染的第一道防線，是宿主細胞自身受外界刺激下啟動的死亡程序，不利于病毒復制。但許多病毒卻可以利用細胞某些調(diào)控機制延遲或者抑制細胞發(fā)生凋亡，從而有利于自身復制。本試驗初步揭示了CSFV誘導的miR-214的功能和作用，表明在CSFV感染過程中miR-214可能參與調(diào)控細胞凋亡，從而有利于CSFV在細胞內(nèi)的復制和持續(xù)性感染，為了解CSFV的致病機制提供新的方向，也為防控CSFV感染尋找新的作用靶位提供一個新的思路。

4 結論

利用miRNA表達譜芯片篩選CSFV感染PK-15細胞后差異表達的miRNAs，結果表明，CSFV感染PK-15細胞誘導69條差異表達的豬源miRNAs，其中包括上調(diào)表達的39條，下調(diào)表達的30條。

CSFV感染PK-15細胞后上調(diào)miR-214表達，且miR-214抑制PK-15細胞凋亡，促進CSFV RNA的復制。miR-214靶向于TRADD蛋白，作用于TRADD 3′UTR。即CSFV感染宿主細胞后，通過促進miR-214的表達從而抑制TRADD的表達水平，達到抑制細胞凋亡的目的，使CSFV實現(xiàn)持續(xù)感染。

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Screen of MicroRNAs in Classical Swine Fever Virus-Infected PK-15 Cells and the Regulation of Virus Replication by miR-214

DENG ShaoFeng, YE ZuoDong, FAN ShuangQi, CHEN JinDing , ZHANG JingYuan, ZHU MengJiao, ZHAO MingQiu

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

【Objective】In this study, differential expression of miRNAs in CSFV-infected PK-15 cells were determined by miRNA expression array, and further explore the function of miRNAs in the pathogenic of Classical swine fever virus (CSFV), and provide some new basis for the prevention and control of Classical swine fever (CSF) .【Method】In order to investigate the changes of the miRNAs expression in CSFV-infected PK-15 cells, we synthesized probes of 326 miRNAs of pig according to the miRBase database version 19.0, and screening of differential expression of miRNAs in CSFV-infected PK-15 cells using miRNA expression array. Then, miR-214, the most obvious difference in expression of CSFV-infected PK-15 cells, was selected as the further study object to investigate the function of miR-214 in the infection process of CSFV. We detected mRNA expression of miR-214 in CSFV-infected PK-15 cells using qRT-PCR. In order to further study the effect of miR-214 of CSFV infection, we synthesized miR-214 analog and inhibitor and transfected into PK-15 cells respectively, follow with CSFV infection at 24 h post-transfection, and then detected CSFV titers and quantity of CSFV genomic copies. In order to further explore the mechanism of miR-214 participate in the regulation of CSFV replication, we predicted the target protein of miR-214 using bioinformatics software and confirmed it by luciferase reporter gene system. Given TRADD can specific interacts with TNFR1 intracellular dead zones and participate in the programmed cell death, we assume that miR-214 influencing apoptosis of PK 15 cells by influencing expression level of target protein TRADD. PK 15 cells transfected with miR-214 and inhibitor respectively, follow with CSFV infection at 24 h post-transfection. At 48 h post-infection, the expression levels of TRADD were detected, and the effect of miR-214 on the apoptosis of CSFV-infected PK-15 cells was detected by flow cytometry. 【Result】69 miRNAs with different expressions were screened by miRNA expression array in CSFV-infected PK-15 cells. Among which the expression changes of miR-214 were most obvious and up-regulated, and confirmed it by qRT-PCR. After transfected with miR-214 to PK-15 cells, CSFV titers and quantity of CSFV genomic copies decreased significantly, while transfected with miR-214 inhibitor, CSFV titers and quantity of CSFV genomic copies were increased significantly, which suggested that miR-214 promoted the replication of CSFV. In order to further explore the mechanism of miR-214 promoting CSFV replication, we confirmed TRADD is the target protein of miR-214. After transfected miR-214 to PK-15 cells, mRNA and protein expression of TRADD were increased significantly, while transfected with miR-214 inhibitor, that were decreased significantly, suggesting that miR-214.inhibits the expression of TRADD. And then, we verified that CSFV infection inhibits apoptosis of PK-15 cells, and miR-214 inhibits apoptosis of CSFV-infected PK-15 cells. 【Conclusion】The expression of miR-214 in cells was up-regulated after CSFV infected PK-15. miR-214 inhibits the apoptosis of PK-15 cells and promote the replication of CSFV in cells by targeting inhibits the expression of TRADD protein.

CSFV; miRNA; replication; TRADD; apoptosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.014

2018-04-18；

2018-09-07

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0501104，2017YFD0500600）、廣州市科技計劃項目（201803020005）、國家自然科學基金（U1405216，31472200，31672590）

鄧少鋒，E-mail：dsf4530@126.com。通信作者趙明秋，E-mail：zmingqiu@scau.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）